BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明专利技术在已建立的MTX耐药细胞进化模型中，选取含DMs的耐药细胞为研究对象，通过确定BRCA1蛋白在HT29含DMs的耐药细胞中的高表达，进一步探讨BRCA1蛋白及其所在通路与含有DHFR耐药基因的双微体稳定存在的关系。本发明专利技术利用脂质体转染方法构建了稳定干扰BRCA1的HT29MTX耐药克隆，并利用Western Blot，FISH，Real-time PCR，MTT和免疫荧光等方法，分别检测了干扰BRCA1对细胞耐药性、DHFR基因的扩增程度及扩增形式、DNA双链断裂及双链断裂修复途径、细胞周期及微核外排的影响。从而确定抑制BRCA1蛋白可以促进DMs外排，逆转肿瘤细胞对MTX耐药。

【技术实现步骤摘要】
BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用
本专利技术涉及BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗

技术介绍
氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是恶性肿瘤治疗中的一个有效的抗代谢药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成、特异性地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但是，由于长时间的用药会导致耐药性的产生，从而严重影响药物的疗效，所以克服MTX耐药是提高其肿瘤治疗疗效的关键。MTX耐药分为先天耐药和获得性耐药。其中MTX获得性耐药的机制可以概括为以下三类：第一、还原性叶酸载体(Reducedfolatecarrier,RFC)的缺失或功能缺陷致使MTX的摄入量减少；第二、胞内多聚谷氨酸合成酶(Folylpolyglutamatesynthetase,FPGS)活性下降或表达降低导致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，产生耐药；第三、MTX的靶酶DHFR水平升高导致的耐药，DHFR表达增强通常是由DHFR基因扩增引起的。基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不稳定性的一种主要形式。基因扩增会形成两种主要的细胞遗传学结构，即染色体外元件双微体(Doubleminutes,DMs)及染色体上的异常结构均质染色区(Homogeneousstainingregions,HSRs)。1962年，人们首次在结肠癌细胞中发现DMs。DMs是染色体外成对环状，能自主复制的染色小体。DMs没有着丝粒，在细胞分裂中随机分配，正因为如此，DMs随时面临着丢失的风险。但是，DMs本身带有的扩增基因或者与耐药相关的基因能为细胞本身提供生长优势，因此在群体中会出现DMs逐渐增多的现象。人们最早在人神经母细胞瘤细胞系及耐MTX的中国仓鼠细胞系中发现了均质染色区。应用G显带技术发现一段缺乏典型带纹的染色体片段，并称其为均质染色区或异常显带区域。研究发现，包含DHFR耐药基因的DMs数量减少会逆转细胞对MTX的耐药情况。而目前DMs减少的机制还不十分明确。根据实验室前期结果及相关文献报道，我们推测使DMs数量减少的原因主要有以下两种：第一，DMs转化为HSRs；第二，DMs以微核形式外排。目前研究表明，微核外排具有典型的细胞周期依赖性，主要发生在G0期和M期。因此，细胞周期进程加快可能导致微核外排量增加，进而促进细胞内DMs数量的减少。基因扩增产生的前提条件是DNA双链断裂(doublestrandsbreak，DSB)的发生。在此基础上，细胞对于DSB的修复能力异常增加。DSB修复主要存在两种机制，同源重组修复(homologousrecombinationrepair，HR)是其中较为精确的修复机制。因此，HR的异常表达可能会影响肿瘤细胞中基因扩增的程度。HR的主要参与蛋白包括：PI3K家族成员ATM、剪切酶复合体MRN(MRE11/RAD50/NBS1)、BRCA1、BRCA2、RAD51及其类似物家族、RAD52、RAD54、RecQ解旋酶等。其中，BRCA1是重要的核心分子之一。研究发现，BRCA1不仅可竞争性抑制53BP1，启动HR；它还能与MRN复合体相结合完成DNA末端的剪切；促进RAD51的募集以保证链入侵的顺利进行；此外，它还能够影响细胞周期检查点，是细胞周期的重要调控因子。本研究针对BRCA1进行干扰后发现，细胞内DSB累积急剧增加；研究还发现，干扰BRCA1能够加快细胞周期进程，使含有DHFR扩增基因的微核外排增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转肿瘤细胞的耐药情况，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。
技术实现思路
针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复发的现象，本专利技术提供了BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。本专利技术中，优选的，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为10-4mol/LMTX的人结肠癌细胞。本专利技术的技术方案是构建人结肠癌细胞系HT29MTX耐药的进化模型，检测BRCA1在肿瘤细胞耐药过程中是否发挥作用，然后，将BRCA1shRNA和ControlshRNA分别转入含DMs的耐药细胞中，获得稳定克隆，应用MTT，IC50分析，流式细胞术，Real-timePCR，FISH，WesternBlot等技术方法，检测细胞转染前后的生长、耐药、周期、DSB、DSB修复通路功能和扩增基因外排等情况，明确BRCA1是否通过参与同源重组修复及细胞周期调控维持基因扩增，参与细胞耐药。抑制BRCA1后可否外排细胞中的耐药扩增基因，进而逆转肿瘤耐药。我们通过稳定干扰BRCA1，阻断HR修复途径也同时影响了细胞周期，以探究BRCA1与基因扩增之间的关系。从而为揭示新的治疗靶点、更加有效对抗MTX耐药提供科学的依据。1.细胞培养构建进化模型人结肠癌细胞系HT29在含有15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于5％CO2、37℃条件下，用浓度梯度递增的MTX连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT2910-7mol/LMTX，HT2910-6mol/LMTX，HT2910-5mol/LMTX，HT2910-4mol/LMTX。将HT29MTX敏感细胞命名为HT29MTXS。待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药，然后再用其做后续实验。2.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化(1)应用QIAmpDNAminikit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞系基因组DNA的提取，应用Real-timePCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因的扩增程度。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX耐药浓度升高而增加。(2)细胞中期核型标本制备，FISH检测DHFR基因扩增形式的变化与HT29MTX敏感细胞相比，基因扩增的形式由HSRs逐步转变为以DMs为主的方式，尤其当耐药浓度达到10-4mol/L时，细胞系中出现以DMs为主的基因扩增形式。因此，我们选取HT2910-4mol/LMTX耐药细胞作为含DMs的耐药细胞进行后续研究，并命名为HT29MTXDMs。3.HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化提取细胞总蛋白，应用WesternBlotting方法检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平随着MTX耐药浓度升高而增加。4.BRCA1表达分析提取细胞总蛋白，应用WesternBlotting方法检测BRCA1在HT29MT本文档来自技高网...

【技术保护点】
BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，其中，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为10-4mol/LMTX的人结肠癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥宁，蔡梦迪，李春香，朱静，刘鹏，高巍，关荣伟，侯丽青，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23