一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法，利用SNP作为遗传标记，结合高通量测序技术进行产前亲权关系的判定，只需提供母亲外周血10ml，在母亲外周血浆中提取的游离DNA已经包含了胎儿的游离DNA，所以母亲和胎儿只需一份样品即可。由于只需抽取孕妇的静脉血，操作简便，因此不会对孕妇和胎儿造成创伤，且孕10周后即可鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法。
技术介绍
亲子鉴定是根据人类遗传学的理论和实践，从子代和亲代的形态构造或者生理机 能方面的相似特点，分析遗传特征，对可疑的父子关系或母子关系进行判断，并作出肯定或 者否定的结论。 判断亲子关系的理论依据是孟德尔遗传的分离律。按照这一规律，在配子细胞形 成时，成对的等位基因彼此分离，分别进入各自的配子细胞。精、卵细胞受精形成子代，孩子 的两个基因组一个来自母亲，一个来自父亲：因此，同对的等位基因也就是一个来自母亲， 一个来自父亲。如果鉴定结果符合这一规律，则不排除亲生关系；若不符合，则排除亲生关 系（基因变异情况除外）。最早用于检测遗传多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基 因组中可变数目的串联重复（VNTR)做限制性片段长度多态性分析。随着技术的进步，DNA 聚合酶链式反应（PCR)，使得较短的核酸片段也能用于分析，将分析目标集中到VNTR中的 较短的短串联重复序列（STR)，加上多重PCR技术的应用，迅速使STR基因座的分型检测在 法医和刑侦中应用起来。STR也成为目前最常用的遗传标记。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)是第三代遗传学标记， 这种遗传标记是由于单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群 体中的频率不少于1 %。与第一代的RFLP及第二代的STR以长度的差异作为遗传标记的特 点截然不同。SNP的分布密集，如果以1%的频率计算，在人基因组中就有300万个以上的 SNP遗传标记，这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好 的遗传标记物。在医学遗传学、群体遗传学和药物基因组学中有广泛的应用。在法医物证 检验中，也由于SNP的含量丰富、遗传稳定，而引起了高度重视。 产前亲子鉴定，也称胚胎期亲子鉴定、胎儿亲子鉴定，是指利用基因技术鉴定胎儿 生物学意义上的父亲。现有产前亲子鉴定技术是从胎儿绒毛或者孕妇羊水中提取DNA物 质，鉴定检测出胎儿的STR与疑似父亲的DNA进行比对，以确认亲子关系。 现有技术中产前亲子鉴定通常需要利用羊水穿刺术抽取3-5毫升的羊水，但是抽 取出来的羊水必须比较清澈透明，不能含有母亲的血液成分。虽然羊水穿刺术用于产前诊 断至今已有30年的历史，准确性得到了医学界的公认。但羊水穿刺的难度较大，目前均需 在具备三甲、大型医院采用B超可视监控的引导下完成，却仍有0. 5% -1 %的宫内感染和流 产风险。
技术实现思路
本专利技术的主要目的即在于克服现有技术的缺点，提供一种无创的利用SNP进行产 前亲权关系判定的方法。 本专利技术采用如下的技术方案： -种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法，利用SNP作为遗传标记，结合高通量 测序技术进彳丁广如亲权关系的判定，包括如下步骤： 步骤一，设计SNP位点及引物； 步骤二，提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA ; 步骤三，样品DNA的高通量测序前处理； 步骤四，高通量测序； 步骤五，高通量测序数据后处理，并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点； 步骤六，将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP位点进行对比，最高 碱基类型相同的位点定义为一个一致位点，最高碱基类型不同则将该位点定义为一个否定 位点，统计出一致位点和否定位点的数目； 步骤七，当否定位点数目大于等于5个即可否定胎儿与待定男性的亲缘关系，当 一致位点数目大于等于35个则不能否定胎儿与待定男性的亲缘关系。 上述步骤一中选择最小等位基因频率为0. 4-0. 5的SNP位点。 上述步骤三包括：扩增含有SNP位点的片段，纯化扩增到的PCR产物，并将PCR产 物末端修复，筛选得到平末端DNA片段，接头连接，得加接头的DNA片段，PCR扩增及纯化得 到小片段文库，检测小片段文库的文库浓度和片段大小。 上述步骤五包括： 1)将测序得到的序列进行初步过滤，并与人类基因组序列进行比对，筛选出错配 碱基< 3%的唯一比对序列，然后根据比对结果统计出每个SNP位点的覆盖深度、碱基种类 和每种碱基对应数目； 2)根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基出现次数进行排序，四种碱基种类 按照次数从多到少的顺序分别称作Major_alle、Minor_alle、Third_alle及Fourth_alle， 每种类型喊基出现的次数依次为Major_num、Minor_num、Third_num及Fourth_num，并得出 SNP位点的覆盖深度Depth，Depth等于四种碱基数目之和，即Detph = Major_num+Minor_ num+Third_num+Fourth_num ； 3)计算出在SNP位点中出现次数最多的碱基占该位点总覆盖深度的比例，即最高 碱基比例Major_percent = Major_num/Detph，筛选出覆盖深度Detph大于200层，且最高 碱基比大于99 %的位点。 上述孕妇样本采自孕妇外周血。 本专利技术的一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法与现有技术相比，利用SNP 作为遗传标记，结合高通量测序技术进行产前亲权关系的判定，只需提供母亲外周血IOml， 在母亲外周血浆中提取的游离DNA已经包含了胎儿的游离DNA，所以母亲和胎儿只需一份 样品即可。由于只需抽取孕妇的静脉血，操作简便，因此不会对孕妇和胎儿造成创伤，且孕 10周后即可鉴定。【具体实施方式】 以下举例对本专利技术的一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法进行详细说明。 1、设计位点：在人类基因组中，找出最小等位基因频率（MAF)在0. 4-0. 5的SNP位 点，在1-13、18、21这15条染色体上共选出1035个位点，每条染色体上SNP数目相近。（设 计过程中位点数目可变，染色体的分布可变）。 2、设计引物：根据设计的1035个SNP位点，利用ION AMPLISEQ DESIGNER在线设 计网站设计出覆盖目标SNP的引物。（设计引物可以用其他软件代替）。 3、样品DNA提取。 4、扩增含有SNP位点的片段：DNA片段、多重PCR反应酶和SNP Primers混匀后， 进行PCR反应。 5、纯化扩增到的PCR产物。 6、末端修复：将步骤5所得的混和DNA片段、End repair Enzyme与5X End repair Buffer混合，室温下孵育进行反应。 7、片段筛选：对步骤6所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到片段中的平末端 DNA片段。 8、接头连接：将步骤 7 所得的 DNA 片段、ligase Enzyme、IOX ligase Buffer、接 头、BarcodeX混合后，室温下孵育进行反应。 9、片段筛选：对步骤8所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得加接头的DNA片 段。 10、PCR 扩增：对步骤 9 所得混合 DNA 片段、Platinum PCR Super Mix High Fidelity与Library Amplification Primer Mix混合，进行PCR扩增及纯化，得到小片段 文库。 11、文库检测：将步骤10所得的扩增产物采用Qubit和Agilent Bioa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用SNP进行产前亲权关系判定的方法，其特征在于：利用SNP作为遗传标记，结合高通量测序技术进行产前亲权关系的判定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪亮，郑海灵，段利朋，祝兴强，
申请(专利权)人：厦门万基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35