一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳杂交产物，确定待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。该方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性的同时，简化了实验操作且降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修饰、基因功能研究以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术具体涉及一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及 其应用，属于生物

技术介绍
基因组定点编辑技术无论是在生物学基础研宄，还是诸如基因治疗、生物反应器 等生物相关产业中都具有巨大的应用前景。近年来，随着大量物种基因组测序工作的完成， 以及人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN)的出现，基因组编辑技术飞速发展， 逐渐成为科研工作者选择性编辑基因组和研宄基因功能的必备工具。 锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶， ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶。到目前为止，ZFN已相 对比较成熟并成功应用于大鼠、小鼠、猪、牛等动物。但是，要设计并构建出一个切割活性 高、特异性好的ZFNs工作量很大，而且很多基因序列中可能难以找到合适的ZFN靶点，其 技术专利被少数几家商业公司控制，使用成本很高，效率相对较低，这些因素大大限制了 ZFNs的推广。随之，第二代人工核酸酶--类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALENs)出现，由于 TALEN 与 ZFN 相比构建相对 较为简单，编辑效率高，成本低，特异性更高而受到科研工作者的青睐，并迅速应用于小 鼠、斑马鱼、猪和牛等动物。2013年，一种全新的人工核酸内切酶，即第三代人工核酸内 切酶一(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) 9, CRISPR/Cas9)出现，与前两代人工核酸内切酶相比，CRISPR/ Cas9制作更为简单，成本更低，作用效率更高。 上述三种人工核酸内切酶各有优缺点，但是其作用机制基本一致，即通过特异识 别目的DNA序列，对靶标位置的DNA链进行精确切割，从而形成双链断裂（double-strand breaks, DSB)，诱发细胞内源性的修复机制，通过非同源末端连接修复（non-homologous end joining, NHEJ)或者同源重组修复（homologous recombination, HR)对切 口进行修复。 在修复过程中，有可能出现片段的删除或者插入、碱基替换、点突变等定点修饰，所以修复 的结果可能呈多态性。 人工核酸内切酶的种类、设计、转染方式、载体形式以及其他实验条件均会对其工 作效率产生很大影响。目前，人工核酸内切酶编辑效率的检测主要有以下几种方法：（1)限 制性内切酶酶切检测法，即如果在靶位点之间的Spacer存在某个限制性内切酶的酶切位 点，那么该位点在被人工核酸内切酶切割修复后就会遭到破坏，而无法被原有的限制性内 切酶切开。这种方法的优点是廉价、简单、快捷，但其缺点也显而易见，即如果Spacer处没 有合适的限制性内切酶位点，该方法将无法使用。另外，如果人工核酸酶发挥了作用，但是 突变位点不在限制性内切酶所识别的序列，该方法也无法检测，从而造成检测到的突变率 比实际值偏低。（2)将包括靶位点的片段PCR扩增后TA克隆测序，根据测序结果计算编辑 效率和类型，该方法不受序列的限制，但是人工核酸酶的效率很低时，要准确评价其活性并 筛选阳性单克隆细胞需要进行大量的克隆、测序工作，工作量太大、成本太高。（3)基于可识 别错配双链的错配内切酶（主要采用Cel I内切酶和T7E1两种酶）检测法，即在靶位点两 侧设计引物进行PCR反应，产物回收纯化后先高温变性，再缓慢降温复性，然后用Cel I或 者T7E1酶消化，如果靶位点处由于序列插入或者删除而形成泡状结构即可被Cel I或者 ?7Ε1识别切割，该方法操作相对比较简单，但是Cel I和T7E1酶均比较昂贵，如进行大规 模检测成本较高，另外该方法酶切后一般用琼脂糖凝胶电泳检测，灵敏度不高，如果人工核 酸酶的效率很低的时候，使用该方法无法检测。除上述方法之外，还有体内或者体外引入报 告基因法以及体外的SSA(single strand annealing)分析法等。 在使用人工核酸内切酶进行基因组编辑过程中，筛选靶基因被正确编辑的单克隆 细胞是一项庞大的工作，尤其是在人工核酸内切酶效率很低的时候，就更加困难。像ZFN这 样的低效率人工核酸内切酶，尽管Sigma公司描述其编辑效率可以达到1-20%，但是很多 实验室在实际应用过程中所获得的数据却远低于这一标准，例如刘杰等（2014)使用ZFN敲 除猪卵母细胞孤雌胚胎中MSTN基因，打靶效率为0.54%;任广彩等（2014)利用ZFN对转基 因猪成纤维细胞中的增强型绿色焚光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因进行敲除，敲除效率最低为0.97%，最高的一组也仅为1.76% ;Watanabe等（2013)用 ZFN敲除猪胎儿成纤维细胞IL2RG基因的研宄中，打靶效率也只有0. 5%。即使TALEN或者 CRISPR/Cas9这类高效率的人工核酸内切酶，也会由于靶基因序列的特殊性而出现效率很 低的情况，例如吴金青等（2015)利用CRISPR/Cas9对猪IGF2基因进行敲除，由于该基因结 构复杂、GC含量和甲基化程度高，编辑效率始终无法提高，最高也仅为9. 2%。在如此低的 编辑效率下，上述第一种和第三种方法由于灵敏度低而无法检测，若采用上述第二种方法 需要进行大量的克隆、测序才有可能筛到正确的单克隆细胞，工作量太大，实验成本也将非 常尚。 在人工核酸内切酶技术快速发展，基因定点修饰技术已逐渐成为分子生物学实验 室必备的实验技术的形势下，最大限度地提高人工核酸内切酶编辑效率检测技术的灵敏 度，并以此指导后续的单克隆筛选工作，提高实验效率，降低实验成本就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何快速、简单的检测低效率基因编辑。 为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种基因编辑后的DNA产物的检测方法。 本专利技术提供的基因编辑后DNA的检测方法包括如下步骤： 1)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产 物变性、复性，得到杂交产物； 所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA 和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA ; 2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象 差异，确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA 的检测。 上述方法中，所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变野生型DNA的质量百分含量 大于所述突变DNA的质量百分含量。 上述方法中，所述突变DNA为将野生型DNA缺失或突变多个寡核苷酸，其余寡核苷 酸不变得到的DNA。 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量是指【突变DNAA野生型DNA (或者突 变DNA和未突变的野生型DNA))】*100%。 上述方法中，所述突变DNA的质量百分含量具体为0. 1% -0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因编辑后的DNA产物的检测方法，包括如下步骤：1)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)用聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象差异，确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高蕊，张伟，王世银，甘尚权，周平，王立民，陈永林，皮文辉，黄瑾，李冬妹，宋广超，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65