本发明专利技术提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示无精症。本发明专利技术发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机构与医院检验科，男科实验室等推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医疗检测
，具体涉及一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使 用方法。
技术介绍
多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临 床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之 一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原 因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。 传统的男性不育的诊断方法是利用精子的活力分析，精子计数等方法，而这类方 法具有如下的特点： 1、 精子计数受到外界的影响因素较多，如吸烟、饮酒等都会造成结果的波动较大； 2、 精子的活力分析需要昂贵的仪器分析，且与受试者是否近期有同房等因素有显著相 关； 3、 目前的方法都是基于精液的检测方法，收集样本的过程较为繁琐。 而采用血浆的分子标记物的检测方法具有采样简单、直接，可以直接反映病人的 生育水平的特点。如201310112391. 1，名称为"男性不育的生物标志物及其应用"的专利技术专 利申请，检测受试者体液中至少一种指示男性不育生物标志物的水平，其中至少一种指示 男性不育生物标志物选自乙酰肉碱、天冬氨酸、肉碱C3 :1、酮肉碱、亮氨酰脯氨酸、肉碱C8、 甲基黄嘌呤、肉碱C10 :2、肉碱C10 :1、腺嘌呤；所述体液选自受试者尿液、血清、血浆、血液、 精液、精子、精浆、唾液。该检测方法需要高效液相层析分析仪等昂贵的仪器，另一方面，需 要同时检测多个生物标记物，且通过受试者操作曲线（R0C)，这一反映生物标记物的经典方 法发现，即使采用多个标记物组合其曲线下面积（AUC)最高为0. 73,对应的敏感性与特异 性仅为65 %与71%。 201310722584. 9,名称为"一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法"的专利技术专利申 请，通过抽提口腔上皮细胞样本的基因组DNA，再经荧光定量PCR反应检测分析个体的N0S3 基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型，为所有的受检者提供精子细胞凋亡相关基因检测， 并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男 性的不育发病风险进行预测评估。该检测方法是从基因多态的层面提取口腔上皮细胞的 DNA，进行基因扩增后观察基因多态性与无精子的相关情况，从DNA的水平观察其与无精症 的相关情况，其DNA变异与无精症仅为相关性研宄，没有对检测方法与精子产生等参数关 联的具体相关性的资料，敏感性与特异性低，不具有实用性。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用 方法。本专利技术发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA (miRNA)基因miR-15b， miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案： 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR-15b的不同表达 水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过度表达提示男性无精症。 本专利技术所述 miR-15b 的基因序列为：5' -TAGCAGCACA TCATGGITTA C。 本专利技术所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和 miR-15b特异性引物探针。 所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。 所述的正常生精者的血浆中miR-15b含量大于2000万/毫升。 优选地，所述的miR-15b特异性引物探针为Taqman探针，具有高适应性和可靠性， 实验结果稳定重复性好，特异性更高。 本专利技术所述的男性不育诊断的试剂盒的使用方法，步骤如下： A、 RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针 法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值； C、 结果判定：将检测值采用2- AA Ct方法换算成相对表达量，以相对表达值4. 2为临 界值，超过4. 2即推测为无精症。 本专利技术的试剂盒可用于诊断男性无精症，推断男性不育，实现了荧光信号的累积 与PCR产物形成完全同步，其预测男性不育的敏感性与特异性分别为71. 4%与100%，特异性 好，定量结果准确性高，具有良好的检测效能，是测定的金标准。 相对于传统的精子活力与计数的方法相比，有如下优点： 1、检测所需的样本量少，速度快，时间短，可用于评估精子质量与功能的实验室检测， 可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。 2、试剂盒的检测对象为血浆样本，而非从精液中分离精子样本，是一种快速与准 确的筛选男性精子发生障碍的新的方法。 3、本试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机 构与医院检验科，男科实验室等推广。【附图说明】 图1为动物模型的结果分析。 (a)构建通过PGK2启动子在生精细胞特异的过表达miR-15b的转基因小鼠。 (b ) PCR鉴定出阳性的转基因小鼠模型。 (c)miR_15b转基因小鼠的睾丸H & E染色显示出现精子发生缺陷，未成熟精子细 胞脱落。左边为正常对照小鼠睾丸切片。 (d)附睾中收集的精子计数结果。 (e)miR_15b转基因小鼠的曲精小管的直径。 (f) miR-15b转基因小鼠血浆的miR-15b表达。 (g) Western blot结果显示miR_15b调控的下游基因Cdc25a的表达。 图2为男性无精症与正常受试者经试剂盒检测得到的miR_15b相对表达量的分布 图。 图3为本专利技术试剂盒对无精症诊断的特异性和敏感性分布图。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本专利技术的实质性内容作进一步详细的描述。 实施例1 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR_15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR_15b的过高表达提示男性无精症。 实施例2 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。 所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特 异性引物探针。 实施例3 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。 所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特 异性引物探针。 所述的质控品为正常受试者的血浆miR_15b表达水平。 实施例4 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。 所述的男性无精症诊断的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反 应体系和miR-15b特异性引物探针。 所述的质控品为正常生精者的血浆miR_15b表达水平。 所述的miR_15b特异性引物探针为Taqman探针。 实施例5 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR‑15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR‑15b的过度表达提示无精症。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许文明，陈艳，廖惠娟，岳焕勋，杨明，孙华钦，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：四川;51
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