【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种亚胺还原酶或其突变体及应用，具体地，是在合成(s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。
技术介绍
1、莫西沙星原研是德国拜耳公司，2002年在中国获批上市，至2018年中国公立医疗机构莫西沙星终端超过40亿元市场规模，同比增长率29.9％。为第四代喹诺酮类广谱抗菌药，莫西沙星在体外显示出对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、抗酸菌和非典型微生物如支原体、衣原体和军团菌有广谱抗菌活性。抗菌机制为干扰ⅱ、ⅳ拓扑异构酶。莫西沙星具有广谱、高效、抗耐药性强、副作用较小等优势，得到广泛的临床应用，具有很好的发展前景。
2、其中((s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷为最为重要的莫西沙星关键中间体。分子结构有哌啶和呲咯烷两个骨架结构和两个手性中心，已报道的制备方法主要分为两种合成路线:哌啶路线和吡咯烷路线。
3、
4、目前该关键中间体在工业上主要以吡啶-2,3-二酸为原料来制备,经醋酐脱水，与苄胺环合后用钯碳催化加氢还原吡啶环，氢化铝锂还原酰亚胺，经d-(-)酒石酸拆分，在甲醇中氢解脱苄得化合物。该路线主要缺点是还原剂氢化铝锂价格昂贵，生产成本较高。另外一种路线以吡啶-2,3-二酸为起始原料，经甲醇酯化、还原酯基后氯代，与对甲苯磺酰胺环合，用钯碳催化加氢还原吡啶环，经r-(-)-扁桃酸拆分后用氢溴酸在苯酚和乙酸中脱去对甲苯磺酰基得。该路线的主要缺点是反应步骤长，且使用工业上禁用的苯酚等试剂，反应条件苛刻，生产成本高。
5、也有采用n-二甲氨基
6、另外一种手性合成路线，以4-取代的-3-吡咯烷酮为原料，通过手性苯乙胺诱导构建手性中心，然后通过转化得到(s,s)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷。该路线起始原料的合成也不容易，手性诱导的效果也不是很好，还需要后续的结晶等进一步纯化。
7、目前国内外文献报道的适合工业化生产的莫西沙星关键中间体制备路线主要有下述四条：
8、路线一：以2，3-吡啶二甲酸为起始原料，在醋酐中与苄胺脱水环合，然后催化氢化还原吡啶，接着在nabh4/bf3体系还原羰基，再经酒石酸拆分和氢化脱苄得到(s,s)-2,8-二氮杂双环[4.3.0]壬烷。此路线合成文献报道较多也是目前使用最广泛的路线。还原羰基时会使用大量的价格较高的还原剂nabh4，从而导致成本较高，且后处理繁琐，同时会产生大量的固废不环保。
9、
10、该路线使用手性拆分试剂，造成原料浪费；还原羰基时会使用大量的价格较高的还原剂nabh4，从而导致成本较高。
11、路线二：n-二甲氨基丙烯亚胺和n-甲基顺丁烯亚胺为原料完成关环反应，随后在氢气作用下得到二羰基化合物中间体。依次使用四氢铝锂和氢气还原羰基和吡啶环，实现消旋氮杂双环的合成，后续经过手性拆分以及氢解脱苄，实现莫西沙星关键中间体的合成。其原料不易采购，需要自己制备。
12、
13、该路线需要使用手性拆分试剂，造成原料浪费。原料2-丙烯醛-二甲基腙不易得到，不易于工业生产。
14、路线三：通过不对称合成的方法，以3-吡咯烷酮化合物为原料，与1-氯-3-碘丙烷进行取代反应，得到的化合物酸性条件下脱去酯基，然后和(r)-1-苯乙胺进行还原氨化，再分子内缩合环化，最后催化加氢脱去保护基即可得到(s,s)-2,8-二氮杂双环[4.3.0]壬烷。此路线合成较为繁琐，原料价格昂贵，生产成本较高。
15、
16、该线路中起始物料不易购买，不易于工业生产。需使用两次氢化过程，合成路线较为繁琐。
17、路线四：另有一篇专利公布了一种此咯烷路线的不对称合成方法该路线采用r-苯乙胺手性诱导、氢化的方法构建两个手性中心,然后发生分子内关环、脱除手性辅基及保护基得到目标产物。
18、
19、该路线中需要使用手性原料控制手性，手性原料较贵。起始物料不易购买，不易于工业生产。
20、当前技术缺陷在于关键手性中间体合成过程中利用手性拆分方式实现，会造成原料浪费，除此之外会使用价格较高的硼氢化钠作为还原剂，或者另外合成路线也较为繁琐，对环境污染较大。
技术实现思路
1、为了克服上述技术难题，本专利技术提供了一种亚胺还原酶或其突变体及应用，具体地，是在合成(s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。
2、本专利技术提供了一种亚胺还原酶，它的核苷酸序列如seq id no.2所示的ir2。
3、ir2的氨基酸序列如seq id no.12所示。
4、本专利技术提供了一种亚胺还原酶突变体，它是所述的ir2的突变体，其包含在seq idno.12所示氨基酸序列中具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：
5、将第22位的甲硫氨酸(m)取代为半胱氨酸(c)；
6、将第41位的天冬氨酰(n)取代为组氨酸(h)；
7、将第74位的半胱氨酸(c)取代为丝氨酸(s)；
8、将第183位的亮氨酸(l)取代为半胱氨酸(c)；
9、将第217位的甲硫氨酸(m)取代为亮氨酸(l)。
10、本专利技术提供亚胺还原酶或亚胺还原酶突变体在催化合成(s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。
11、其中，所述的催化合成((s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的底物为：
12、
13、所述的n＝0，1，2，3…
14、r可以为以下基团：乙氧羰基、甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、三苯甲基、对甲氧基苄基。
15、本专利技术提供了一种合成((s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，它是由式i或式ii的底物，与所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体，经酶法合成(s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物，其中，
16、所述的底物为：
17、
18、所述的n＝0，1，2，3…
19、r可以为以下基团：乙氧羰基、甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、三苯甲基、对甲氧基苄基。
20、进一步地，它包括如下步骤：
21、a、取重组质粒转化、诱导表达亚胺还原酶(ired)或亚胺还原酶(ired)突变体、葡萄糖脱氢酶(gdh)；
22、b、加入葡萄糖、nadp钠盐、底物，在室温下振荡反应，即得。
23、8、根据权利要求6或7所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亚胺还原酶，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的IR2。
2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶，其特征在于：IR2的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
3.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于：它是权利要求1或2所述的IR2的突变体，其包含在SEQ ID No.12所示氨基酸序列中具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：
4.权利要求1或2所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体在催化合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的催化合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的底物为：
6.一种合成((S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物的方法，其特征在于：它是由式I或式II的底物，与权利要求1或2所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体，经酶法合成(S,S)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物，其中，
7.根据权利要求6所述
8.根据权利要求6或7所述的合成方法，其特征在于：所述的底物的合成路线是：
...【技术特征摘要】
1.一种亚胺还原酶，其特征在于：它的核苷酸序列如seq id no.2所示的ir2。
2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶，其特征在于：ir2的氨基酸序列如seq id no.12所示。
3.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于：它是权利要求1或2所述的ir2的突变体，其包含在seq id no.12所示氨基酸序列中具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：
4.权利要求1或2所述的亚胺还原酶或权利要求3所述的亚胺还原酶突变体在催化合成(s,s)-2,8-二氮杂二环[4,3,0]壬烷或其衍生物中的应用。
5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾知军，魏涛，张国庆，李茹，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：
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