评价内体运输的测定制造技术
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评价内体运输的测定本专利技术涉及用于评价分子递送到真核细胞内的效率的测定和相应试剂盒。任何潜在治疗分子发挥功效的关键要求是其必须能够表现出良好的效能。本专利技术涉及经由熟知的内吞过程进入真核细胞胞质的分子。鉴于此，重要的是理解该细胞进入模式所涉及的步骤。因而，为了帮助例示与该细胞进入模式相关的关键步骤，可参考图1。在步骤1中，分子与细胞表面上存在的结合位点(例如受体或接受体)结合。在步骤2中，受体(加上结合的分子)变成内化到细胞中-该步骤通称为“内吞”或“内体形成”。在步骤3中，在内化之后，分子插入内体膜，并实现所述分子(或其一部分)从内体内、穿过内体膜和进入真核细胞胞质的释放。一旦在胞质中(步骤4)，所述分子能够作用于其胞内靶(例如抑制靶分子，如蛋白水解切割细胞靶蛋白)。因此良好效能测试有赖于准确评价一个或多个上述步骤。迄今为止，对能够经由“受体介导的内吞”进入真核细胞的分子的效能测试集中在毒性分子如梭菌神经毒素。举例而言，以下测定已被用于市售的梭菌神经毒素(例如肉毒杆菌神经毒素，其市售名诸如DysportTM,NeuroblocTM和BotoxTM)。小鼠LD50测定是目前唯一经FDA批准用于发布肉毒杆菌毒素的测定。该测定同时测试肉毒杆菌神经毒素的所有三个结构域的作用(即结合、易位和蛋白酶)。更具体而言，其限定该毒素在限定时间点(通常在给药后2-4天)的半数致死腹膜内剂量(活性以小鼠LD50单位表示)。然而令人遗憾的是，LD50测定使用大量动物。而且，LD50单位不是绝对测量值，因为其不是生物学常数-由此其高度取决于测定条件。特别是，伴随该测定的误差在不...
【技术保护点】
评价测试分子的内体释放能力的测定，所述测定包括：i)使真核细胞与有待评价内体释放能力的测试分子接触，其中所述真核细胞包含细胞膜，其包括存在于所述细胞的细胞膜外表面上的结合位点；ii)使测试分子与所述真核细胞温育，并由此允许a)测试分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有测试分子；和c)所述测试分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；iii)除去未与存在于真核细胞上的结合位点结合的过量测试分子；iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的测试分子的量；v)将步骤iv)中检测到的测试分子的量与对照值相比较，其中所述对照值代表在步骤iv)之前存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量或存在于胞质中的测试分子的量；vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的测试分子的量的相对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的测试分子的量的相对变化，计算测试分子的内体释放值。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.23 GB 1219024.51.评价测试分子的内体释放能力的测定，其中所述测试分子为梭菌神经毒素，或重靶向的非细胞毒性蛋白酶即靶向分泌抑制剂，其中所述非细胞毒性蛋白酶的天然结合能力通过引入结合配体或靶向部分而修饰，并且其中所述测试分子有能力蛋白水解切割从而灭活SNARE蛋白；所述测定包括：i)使真核细胞与有待评价内体释放能力的测试分子接触，其中所述真核细胞包含细胞膜，其包括存在于所述细胞的细胞膜外表面上的结合位点；ii)使测试分子与所述真核细胞温育，并由此允许a)测试分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有测试分子；和c)所述测试分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；iii)除去未与存在于真核细胞上的结合位点结合的过量测试分子；iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的测试分子的量；v)将步骤iv)中检测到的测试分子的量与对照值相比较，其中所述对照值代表在步骤iv)之前存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量或存在于胞质中的测试分子的量；vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的测试分子的量的相对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的测试分子的量的相对变化，计算测试分子的内体释放值；其中步骤(iv)包括使用荧光标记检测所述测试分子。2.权利要求1的测定，其中所述真核细胞选自：昆虫细胞，脊椎动物细胞，植物细胞和真菌细胞。3.权利要求1的测定，其中所述真核细胞为酵母细胞。4.权利要求1的测定，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。5.权利要求1的测定，其中温育步骤ii)进行从5分钟到5天的时间段。6.权利要求5的测定，其中温育步骤ii)进行1-12小时。7.权利要求6的测定，其中温育步骤ii)进行2-10小时。8.权利要求6的测定，其中温育步骤ii)进行4-8小时。9.权利要求6的测定，其中温育步骤ii)进行6-8小时。10.权利要求2的测定，其中温育步骤ii)进行从5分钟到5天的时间段。11.权利要求10的测定，其中温育步骤ii)进行1-12小时。12.权利要求11的测定，其中温育步骤ii)进行2-10小时。13.权利要求11的测定，其中温育步骤ii)进行4-8小时。14.权利要求11的测定，其中温育步骤ii)进行6-8小时。15.前述权利要求任一项的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后5分钟到5小时之间进行。16.权利要求15的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后15-240分钟之间进行。17.权利要求16的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后30-180分钟之间进行。18.权利要求16的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后45-150分钟之间进行。19.评价测试抑制剂分子对真核细胞中的内体运输的抑制效应的测定，所述测定包括：i)使真核细胞与结合所述真核细胞表面上存在的结合位点的对照分子接触，其中所述对照分子为梭菌神经毒素，或重靶向的非细胞毒性蛋白酶即靶向分泌抑制剂，其中所述非细胞毒性蛋白酶的天然结合能力通过引入结合配体或靶向部分而修饰，并且其中所述对照分子有能力蛋白水解切割从而灭活SNARE蛋白；其中所述对照分子与结合位点形成结合复合物，通过内吞进入真核细胞，在此期间形成含有对照分子的内体，并且其中所述对照分子通过穿越内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；ii)使对照分子与所述真核细胞温育，并由此允许a)对照分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有对照分子；和c)所述对照分子通过穿...
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