二次脱毒法培育草莓种苗的方法技术

本发明专利技术属于草莓种苗繁育领域，尤其涉及一种二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：选取草莓匍匐茎尖分生组织进行第一次脱毒，其诱导的试管苗茎尖分生组织进行第二次脱毒等步骤。该方法利用田间草莓匍匐茎尖组织及其诱导的试管苗分生组织进行两次脱毒，培养出核心母株。培育出的脱毒草莓苗长势强健，结果率提高，产量高，品质优，经济效益高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于草莓种苗繁育领域，尤其涉及一种二步脱毒法培育草莓种苗的方法。
技术介绍
草莓(Fragaria X ananassa ) 是蔷薇科草莓属多年生草本植物。近年来草莓种植面积发展很快，世界总产量在浆果类水果中己经跃居第2位。我国是世界草莓属植物种类分布最多的国家，同时也是世界上草莓栽培面积最大、产量最多的国家。草莓长期无性繁殖和连作而导致种性退化以及植株被感染了病毒病，常表现为植株矮化、抗逆性降低、畸形果增加、果实品质下降，单位面积产量降低。草莓病毒病在世界各地分布广泛，其中草莓轻型黄边病毒( Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV)是分布较广、危害较重的最主要的RNA病毒。目前，草莓主要采用热疗法、化学抑制剂法和茎尖组培法培育脱毒苗。热疗法更适合木本果树，高温胁迫将影响草莓试管苗分生组织的分化。逆转录酶抑制剂能够抑制RNA病毒逆转录酶活性，同时也会影响胚性愈伤组织的分化成芽的诱导率。常规茎尖培养操作难点是解剖体积过大的茎尖组织 (大于5 mm)进行诱导，接种外植体可能任然感染微量病毒，从而降低了脱毒效率。然而使用更小体积的茎尖组织（小于0.1 mm）进行诱导，由于较低的不定芽诱导率从而降低脱毒种苗的产量。因此我们开展了二步脱毒法繁育种苗研究，先解剖大体积的匍匐茎分生组织为外植体诱导产生试管苗，再解剖小体积的试管苗茎尖组织为外植体诱导脱毒种苗。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种二步脱毒法培育优质脱毒草莓种苗的方法，先取草莓匍匐茎分生组织，诱导获得试管苗；再取试管苗茎尖分生组织（约1 mm），诱导获得脱毒母株。脱毒草莓苗长势强健，结果率提高，产量高，品质优，经济效益高。解决以上技术问题的的本专利技术中的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括杀菌、制备培养基、脱毒、炼苗和移栽步骤，其特征在于：所述脱毒为二次脱毒，即先取匍匐茎3-5 mm茎尖组织诱导成试管苗，再取试管苗0.5-1 mm茎尖组织诱导成脱毒种苗。所述诱导为在培养基上诱导，依次经过不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基，其中三种培养基配方分别为：不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.5-2.5 mg/L，NAA 0.05-0.15 mg/L，蔗糖25-35 g/L，琼脂粉6-7 g/L；草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.3-0.8 mg/L+IBA 0.05-0.15 mg/L，水解酪蛋白0.05-0.15mg/L， 蔗糖15-23 g/L，琼脂粉5-6 g/L；生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖16-24 g/L ，琼脂粉5-6 g/L。Ms培养基配方：大量元素：KNO3 1.9 g/L、NH4NO3 1.65 g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KHPO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L微量元素：MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·7H2O 0.25mg/L、CuSO4.5H2O4  0.025mg/L、CoCL2.6H2O 0.025mg/L铁盐：Na2-EDTA 37.3mg/L、FeSO4.4H2O 27.8mg/L有机物：甘氨酸 2.0 mg/L、盐酸吡哆醇 0.5 mg/L、盐酸硫铵素 0.1 mg/L、烟酸 0.5 mg/L、肌酸 100 mg/L优选方案中所述三种培养基配方分别为：不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2 mg/L，NAA 0.1 mg/L， 蔗糖30 g/L，琼脂粉6.5 g/L；草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.5 mg/L，IBA 0.1 mg/L，水解酪蛋白0.1mg/L，蔗糖20 g/L ，琼脂粉5.5 g/L；生根培养基含有Ms 培养基，蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 g/L；本专利技术中二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：制备方法具体步骤包括以下：（1）    选取草莓匍匐茎，用湿润纸包裹， 4-5℃暂存；（2）    杀菌：乙醇灭菌1-2 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；然后升汞灭菌2-3 min，用灭菌水洗涤2-3次，1-2 min/次，再除去多余水分；乙醇和升汞进行组织的表面消毒，除去多余水分后接种于培养基表面，可让被诱导的茎尖组织充分接触到培养基。（3）    制备培养基：不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基；（4）    第一次脱毒：解剖镜下取匍匐茎的茎尖分生组织3-5 mm，置于不定芽诱导培养基，诱导产生丛生状的不定芽；不定芽长至2-3 cm并具有两片以上的真叶，切下不定芽转至草莓增殖培养基长成小植株；小植株长至4-6 cm转移至生根培养基生根成试管苗，脱去细菌和真菌。（5）    第二次脱毒：以步骤（4）中试管苗为材料，取其茎尖组织0.5-1 mm置于不定芽诱导培养基；按照步骤（4）中脱毒步骤进行脱毒，得生根的试管苗，即脱毒种苗；（6）    炼苗：用灭菌水将脱毒种苗根上的培养基琼脂清洗干净后，装在盛有清水的瓶中在组培室中炼苗3-5 d；（7）    移载：组培苗移栽盛有灭菌基质的花盆中，置于阴凉处抽发匍匐茎子苗。所述乙醇为75%医用乙醇，升汞为0.1 % 升汞。所述灭菌水为超纯水。所述灭菌基质为草炭：蛭石=7：3的混合物。    本专利技术取草莓匍匐茎尖组织进行第一次茎尖脱毒，可以脱去细菌、真菌等微生物。以试管内组培苗的茎尖分生组织进行第二次茎尖脱毒，可以脱去草莓轻型黄边病毒（SMYEV），成功培育出脱毒种苗；再利用脱毒草莓种苗为母苗，繁育匍匐茎子苗。利用本专利技术中的培育方法，培育出的脱毒草莓苗长势强健，抗逆性强，具有更优良的商品果率，产量高，品质优，经济效益也会显著提高，为冬草莓产业的健康发展提供了优质的种苗。附图说明图1为本专利技术中脱毒母株分别用普通PCR和Real time PCR分别扩增SMYEV病毒的外壳蛋白基因SMYEVcp（1,2,3和4分别代表经过二步脱毒法的母株5-1-2，母株5-2-2，感染病毒的阳性对照和清水阴性对照，其中M为Marker DL2000）图2为本专利技术中Real time PCR检测经过二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗（1,2,3,4,5和6分别代表感染病毒的阳性对照、子苗9-1-1、子苗9-1-2、子苗9-1-1、子苗9-1-2和清水对照）图3为本专利技术中Real time PCR检测只进行第一次脱毒的试管苗与经过二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗（1,2,3,4,5和6分别代表感染病毒的阳性对照、只进行第一次脱毒的试管苗TD-HY、只进行第一次脱毒的试管苗TD-FX、二步脱毒法的母株匍匐茎繁育的子苗9本文档来自技高网...

【技术保护点】
二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括杀菌、制备培养基、脱毒、炼苗和移栽步骤，其特征在于：所述脱毒为二次脱毒，即先取匍匐茎3‑5 mm茎尖组织诱导成试管苗，再取试管苗0.5‑1 mm茎尖组织诱导成脱毒种苗。

【技术特征摘要】
1.二步脱毒法培育草莓种苗的方法，包括杀菌、制备培养基、脱毒、炼苗和移栽步骤，其特征在于：所述脱毒为二次脱毒，即先取匍匐茎3-5 mm茎尖组织诱导成试管苗，再取试管苗0.5-1 mm茎尖组织诱导成脱毒种苗。
2.根据权利要求1中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述诱导为在培养基上诱导，依次经过不定芽诱导培养基、草莓增殖培养基和生根培养基，其中三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 1.5-2.5 mg/L，NAA 0.05-0.15 mg/L，蔗糖25-35 g/L，琼脂粉6-7 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.3-0.8 mg/L+IBA 0.05-0.15 mg/L，水解酪蛋白0.05-0.15mg/L， 蔗糖15-23 g/L，琼脂粉5-6 g/L；
生根培养基：Ms培养基 ，蔗糖16-24 g/L ，琼脂粉5-6 g/L。
3.根据权利要求2中所述的二步脱毒法培育草莓种苗的方法，其特征在于：所述三种培养基配方分别为：
不定芽诱导培养基含有Ms培养基，6BA 2 mg/L，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂粉6.5 g/L；
草莓增殖培养基含有Ms培养基，6BA 0.5 mg/L，IBA 0.1 mg/L，水解酪蛋白0.1mg/L，蔗糖20 g/L ，琼脂粉5.5 g/L；
生根培养基含有Ms 培养基，蔗糖20 g/L +琼脂粉5.5 g/L。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王建辉，刘建军，陈克玲，李洪雯，何建，关兵，何礼，
申请(专利权)人：四川省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51