一种复染环境下细胞DNA定量测量方法技术

本发明专利技术提供了一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，包括以下步骤:首先，将载有脱落细胞的玻片用多种单一纯染料分别染色；然后，对未放入玻片的多光谱成像系统先进行多光谱成像，获得入射光强度的光谱图像，再依次插入纯染料染色的玻片获取光谱图像，据此计算出染料的吸光度；测量出所有染料的吸光度图像，然后综合成公式y＝Xc+e中的矩阵X；计算得到模型M＝(XtX)-1Xt；用复染染料染色后的待分析细胞，用多光谱成像系统测出吸收光谱图像y(λ)，然后用模型M和公式c＝My计算出细胞上各种染料的相对浓度，用和细胞DNA含量成正比的福尔根染料浓度计算出细胞的DNA相对含量。用本发明专利技术提出的方法可以剥离福尔根染色和巴氏染色，可以同时进行细胞DNA定量和细胞形态定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种复染环境下细胞DNA定量测量方法
本专利技术涉及脱落细胞涂片检查方法，尤其是涉及多光谱显微成像及细胞成分定量分析方法，属于细胞染色成像

技术介绍
宫颈癌是妇科高发的恶性肿瘤之一，对宫颈癌及癌变的早期诊断是提高宫颈癌治愈率及生存率的关键。目前我国最常用的宫颈癌筛查方法是TBS分类法，癌症早期诊断需要从上万个细胞中挑选少数几个癌变的细胞，这种方法需要医生来进行长时间人工阅片筛查，极大的增加医生的工作强度和人为误差。用细胞DNA图像定量分析诊断方法进行宫颈癌前病变的诊断已有大量报道，在北美及欧洲细胞DNA图像定量分析诊断方法已作为一种常规临床检测方法之一。在国内，许多大城市也开始用全自动DNA定量分析系统进行宫颈癌筛查。许多研究表明，细胞DNA定量分析诊断方法在早期诊断方面具有更大优势。目前有两种方法来结合TBS和DNA定量检查。一种是将细胞涂片先做DNA染色，用全自动DNA图像定量分析系统进行宫颈癌筛查，找到可以得癌细胞后，将DNA染色再用化学试剂褪色，然后再做巴氏染色复染，方便医生直接复查检查出的癌细胞。缺点是操作复杂，找到的癌细胞有可能在褪色过程中脱落。另外一种方法是做2张细胞涂片，一张巴氏染色做TBS分类，一张福尔根(Feulgen)染色应用全自动DNA定量分析系统做DNA含量测定，临床应用中可一次取材，同时制片，不同染色，两种技术同时检测，可实现优势互补，能显著提高诊断准确率。缺点是DNA定量分析系统找出的异常细胞，医生无法通过熟悉的细胞形态来进行TBS分类。医生还必须仔细重新检查另外一张巴氏染色的载玻片，搜索癌变细胞进行确认。专利技术内容本专利技术提出了一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，可以同时进行细胞DNA定量和细胞形态定量分析；同时在仪器DNA定量扫描找出的癌细胞后，医生可方便的在原位进行医生熟悉的脱落细胞TBS复查。本专利技术的目的通过以下技术方案来具体实现：一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，包括以下步骤：步骤a、将载有脱落细胞的玻片用多种单一纯染料分别染色；步骤b、对未放入染色玻片的多光谱成像系统先进行多光谱成像，获得入射光强度的光谱图像Io(λ)，其中λ为光波长；步骤c、再依次插入纯染料染色的玻片获取光谱图像I(λ)，据此计算出染料的吸光度xi(λ)＝log(Io(λ)/I(λ))；步骤d、重复步骤c，测量出所有染料的吸光度图像xi(λ)，然后综合成敏感度矩阵X，X＝[x1，x2，……xn]，；步骤e、计算得到模型M＝(XtX)-1Xt；步骤f、用步骤a中的所有染料一起复染待分析细胞，将载有染好的待分析细胞的玻片置于显微镜下，用多光谱成像系统测出它的吸收光谱图像y(λ)，依据公式c＝My计算出染料的相对浓度，c＝(c1,c2,c3,……cn)，为染料待测量的浓度；染色前细胞核内DNA经稀酸水解后产生具有还原作用的醛基，所述醛基与福尔根染料结合，福尔根染料的浓度正比于细胞核的DNA含量，从而根据福尔根染料的浓度计算得出细胞核内的DNA含量。所述多光谱成像系统的光谱段大于或等于染料数目，以便计算出染料的相对浓度。所述多光谱成像系统的光谱段采用480nm-680nm的光谱段。在设定的光谱段的基础上，光谱图像采集间隔为10-100nm。所述多光谱成像系统，包括物镜、成像镜、摄像机和计算机，在所述物镜和成像镜之间的光路上安装有电调谐滤光器。所述摄像机安置在成像镜的后端，并且所述摄像机的成像数据与所述计算机对接。进一步的，所述多光谱成像系统还包括控制器，用以控制所述电调谐滤光器在所述物镜和所述成像镜之间的光路上的位置。所述控制器与所述计算机对接，并接受所述计算机的指令，进而控制所述电调谐滤光器的动作。用本专利技术提出的方法可以剥离福尔根染色和巴氏染色。可以同时进行细胞DNA定量和细胞形态定量分析；同时在仪器DNA定量扫描后找出的癌细胞，医生可方便的在原位进行医生熟悉的脱落细胞TBS复查。附图说明下面根据附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。图1是使用染料光谱曲线图，可以看出伊红、亮绿、福尔根染料在可见光波段的吸收光谱存在重叠，因此复染时，伊红和亮绿会干扰福尔根染料浓度的定量测量；图2是本专利技术采用的多光谱成像仪结构图；图3是我们使用液晶调谐滤光器滤光曲线；图4是复染细胞在530nm波段成像效果图，主要反映伊红的光吸收；图5是复染细胞在580nm波段成像效果图，主要反映福尔根的光吸收；图6是复染细胞在50nm波段成像效果图，主要反映亮绿的光吸收；图7是复染细胞采用本文专利技术方法剥离后只剩福尔根染料的效果图，细胞浆上有轻微残留是因为光学系统还是存在色散，尽管我们已采取了减小色散的措施。这从图4-6也可以看出来，图5最清晰，但图4和图6存在模糊；图8是复染后采用本专利技术测得的细胞DNA指数分布图；图9是只用福尔根染色测得的同一例细胞DNA指数分布图。具体实施方式如图1所示，使用染料光谱曲线图，可以看出伊红、亮绿、福尔根染料在可见光波段的吸收光谱存在重叠。如图2所示是我们搭建的多光谱显微成像仪的原理框图。光源1发出的白光照亮载玻片2上染色后的脱落细胞，脱落细胞位于显微镜物镜3的焦点上，因此经过脱落细胞上的点的光线，在经过显微镜物镜3后变成平行光，再经显微镜成像镜6将细胞图像成像在摄像机7的靶面上，这是一般显微镜的工作原理。我们搭建的系统在显微镜物镜3和显微镜成像镜6之间插入了一个电调谐滤光器4(可以是声光调谐滤光器AOTF和液晶调谐滤光器)，计算机8根据需要发出控制信号，并通过电调谐滤光器的控制器5控制电调谐滤光器4只通过需要波段的光线，此时摄像机上采集到的就是该波段的光谱图像。依次调节控制电调谐滤光器4，得到细胞的显微多光谱图像。和一般多光谱成像系统将电调谐滤光器放在显微镜成像镜和CCD之间不同，我们将电调谐滤光器4放在显微镜物镜3和显微镜成像镜6之间。我们知道，当显微镜物镜3和显微镜成像镜6之间采用平行光路时，显微镜物镜3和显微镜成像镜6之间的距离(光程)变化并不影响显微镜的成像。电调谐滤光器4是一个厚光学体，对不同的波长有不同的色散率，因此将将电调谐滤光器放在显微镜成像镜和CCD之间时不同波长焦点不同，难以同时清楚成像，而我们的方案没有此问题，因此有助于实施本专利技术提出的剥离算法。首先，将脱落细胞的涂片用复染的单一纯染料分别染色。启动多光谱成像系统，对未放入染色玻片的系统先进行多光谱成像，获得入射光强光谱图像Io(λ)，其中λ为光波长；然后再依次插入纯染料染色的玻片获取光谱I(λ)，据此可以计算出染料的吸光度xi(λ)＝log(Io(λ)/I(λ))；测量出所有染料的吸光度图像xi(λ)(I＝1–N,N为染料的总数)，然后综合成公式(3)中的矩阵X。然后计算出模型M＝(XtX)-1Xt。(X代表矩阵，Xt代表将该矩阵转置，X-1代表将该矩阵求逆)此后，可以用所有染料复染待分析细胞，将载有染好的待分析细胞的玻片置于显微镜下，用多光谱成像系统测出它的吸光度图像y(λ)，然后依据公式(4)计算出各种染料的相对浓度，由福尔根染料的浓度则可以计算出细胞的DNA含量。只要多光谱成像的光谱段大于或等于染料数目，便可以计算出染料的相对浓度，但适当增加光谱段的数目可以提高测量的精度。考虑到短波段光信号强度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤a、将载有脱落细胞的玻片用多种单一纯染料分别染色；步骤b、对未放入染色玻片的多光谱成像系统先进行多光谱成像，获得入射光强度的光谱图像Io(λ)，其中λ为光波长；步骤c、再依次插入纯染料染色的玻片获取光谱图像I(λ)，据此计算出染料的吸光度xi(λ)＝log(Io(λ)/I(λ))；步骤d、重复步骤c，测量出所有染料的吸光度图像xi(λ)，然后综合成敏感度矩阵X，X＝[x1，x2，……xn]；步骤e、计算得到模型M＝(XtX)‑1Xt；步骤f、用步骤a中的所有染料一起复染待分析细胞，将载有染好的待分析细胞的玻片置于显微镜下，用多光谱成像系统测出它的吸收光谱图像y(λ)，y＝[y1,y2,……yn]，然后依据公式c＝My计算出染料的相对浓度，c＝(c1,c2,c3,……cn)，为染料待测量的浓度；染色前细胞核内DNA经稀酸水解后产生具有还原作用的醛基，所述醛基与福尔根染料结合，福尔根染料的浓度正比于细胞核的DNA含量，从而根据福尔根染料的浓度计算得出细胞核内的DNA含量。

【技术特征摘要】
1.一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤a、将载有脱落细胞的玻片用多种单一纯染料分别染色；步骤b、对未放入染色玻片的多光谱成像系统先进行多光谱成像，获得入射光强度的光谱图像Io(λ)，其中λ为光波长；步骤c、再依次插入纯染料染色的玻片获取光谱图像I(λ)，据此计算出染料的吸光度xi(λ)＝log(Io(λ)/I(λ))；步骤d、重复步骤c，测量出所有染料的吸光度图像xi(λ)，然后综合成敏感度矩阵X，X＝[x1，x2，……xn]；其中，i＝1–n,n为染料的总数；步骤e、计算得到模型M＝(XtX)-1Xt；其中，X代表矩阵，Xt代表将该矩阵转置，X-1代表将该矩阵求逆；步骤f、用步骤a中的所有染料一起复染待分析细胞，将载有染好的待分析细胞的玻片置于显微镜下，用多光谱成像系统测出它的吸收光谱图像y(λ)，y＝[y1,y2,……yn]，然后依据公式c＝My计算出染料的相对浓度，c＝(c1,c2,c3,……cn)，为染料待测量的浓度；染色前细胞核内DNA经稀酸水解后产生具有还原作用的醛基，所述醛基与福尔根染料结合，福尔根染料的浓度正比于细胞核的DNA含量，从而根据福尔根染料的浓度计算得出细胞核内的DNA含量。2.如权利要求1所述的一种复染环境下细胞DNA定量测量方法，其特征在于，所述多光谱成像系统的光谱段大于或等于染料数目，以便计算...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泽兰，曾莉娅，
申请(专利权)人：武汉呵尔医疗科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42