花青素合成调控基因Rosea1的应用制造技术

花青素合成调控基因Rosea1的应用，涉及一种花青素合成调控基因的应用。本发明专利技术提供一种花青素合成调控基因Rosea1、其编码蛋白及其应用。花青素合成调控基因Rosea1用于提高水稻耐盐耐旱性。花青素合成调控基因Rosea1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术将该基因转入水稻中，显著提高了水稻的耐盐耐旱性。

【技术实现步骤摘要】
花青素合成调控基因Rosea1的应用
本专利技术涉及一种花青素合成调控基因的应用。
技术介绍
水稻是重要的农作物，世界上半数以上的人口以稻米为主食，其生长发育在高盐、干旱条件下会受到严重影响，导致产量和品质明显下降。然而干旱、盐泽化土地在全球占了相当大的比重，世界上现有耕地13.7亿平方公里，干旱半干旱地区约占世界土地面积的三分之一；我国干旱半干旱地区的土地面积大约有8.6亿亩，占全国土地面积的52.5％，其中旱地有5.7亿亩，约占全国土地面积的40％，盐泽化土地约占全国土地面积的10％。随着全球气候变暖和人口的不断增加，土地盐泽化和干旱现象将愈发严重，因此，培育耐旱耐盐水稻对于保障粮食生产和粮食安全具有重要的意义。长期以来的常规育种已使水稻的遗传背景日趋狭窄，难以获得耐逆能力强的新品种，因而通过分子生物学手段寻找新的耐逆基因，利用遗传转化的方法将其导入水稻中，提高水稻耐逆性，已成为改良作物，增加产量的重要手段。类黄酮代谢的许多中间物质参与了植物的抗逆反应，例如，ABA介导的胁迫信号反应通路与类黄酮合成途径均需要MYB和MYC类转录因子的参与，借以激活靶基因的表达。金鱼草中的Rosea1基因是MYB类转录因子，通过与花青素合成途径下游的基因相互作用，调控金鱼草花中花色的深浅和分布。
技术实现思路
本专利技术提供一种花青素合成调控基因Rosea1、其编码蛋白及其应用。本专利技术花青素合成调控基因Rosea1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术花青素合成调控基因Rosea1的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术花青素合成调控基因Rosea1用于提高水稻耐盐耐旱性。提高水稻耐盐耐旱性的方法，包括以下步骤：一、将花青素合成调控基因Rosea1转入植物细胞；二、将步骤一中的植物细胞再生成植株。本专利技术花青素合成调控基因Rosea1属于MYB转录因子家族。本专利技术将该基因转入水稻中，显著提高了水稻的耐盐耐旱性。附图说明图1为pCAMBIA1300-Rosea载体；图2为Rosea1基因过表达株系苗期盐胁迫下的表型对比照片；图3为Rosea1基因过表达株系苗期盐胁迫下的存活率；图4为Rosea1基因过表达株系苗期干旱胁迫下的表型对比照片；图5为Rosea1基因过表达株系苗期干旱胁迫下的存活率。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式花青素合成调控基因Rosea1的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。具体实施方式二：本实施方式花青素合成调控基因Rosea1编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。花青素合成调控基因Rosea1的获得方法如下：1、选取发育早期的金鱼草花，使用常规方法提取金鱼草花的总RNA，将金鱼草花的总RNA反转录为cDNA，利用引物AW22100和引物AW22101，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，由下列成分组成：CR扩增条件为：94℃变性5min，接着94℃，1min，55℃，30Sec，72℃，2min进行30个循环，72℃延伸反应10min。二、回收PCR产物与pMD18-T载体相连，转化大肠杆菌DH10B，提取质粒，酶切验证后测序。测序结果表明花青素合成调控基因Rosea1具有序列表中SEQIDNO：1的核苷酸序列，序列表中的SEQIDNO：1由663个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白质。具体实施方式三：本实施方式花青素合成调控基因Rosea1用于提高水稻耐盐耐旱性。为验证本实施方式进行以下实验：实验1：转Rosea1基因水稻的制备(1)pCAMBIA1300-Rosea正义表达载体的构建：以金鱼草花发育早期cDNA为模板，利用引物AW22100和AW22101进行PCR扩增Rosea1基因，回收的PCR产物与pMD18-T载体相连，转化大肠杆菌DH10B，提取质粒，酶切验证后测序。分别用XhoI及BamHI双酶切已连接至pMD18-T中PCR产物及载体pRT101，将目的片段连接，构建pRT101-Rosea，酶切验证正确后，PstI单酶切pRT101-Rosea，回收约为1.4Kb大小的片段(p35S-Rosea-polyA)和同样经PstI单酶切的pCAMBIA1300(pCAMBIA1300载体购买自优宝生物公司)连接，构建载体pCAMBIA1300-Rosea。该载体全长为10278bp(如图1)，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性。所述载体pRT101已在文献《Asetofplantexpressionvectorsfortransctiptionalandtranslationalfusions》(TopferRetal(1987),NucleicAcidsResearch,15(14)，5890)中公开发表，可由中国科学院东北地理与农业生态研究所获得。(2)农杆菌介导法转化水稻愈伤组织(A)水稻愈伤组织的诱导a)取成熟水稻种子，剥去颖壳。先用100mL70％的乙醇(V/V)灭菌5min，再用2.5％的NaClO处理30min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干种皮表面的水分，将其接种到诱导培养基NBD2.0上，在25～28℃避光培养15天左右。b)将在诱导培养基上诱导出的水稻愈伤组织分离，并接种到继代培养基NBD0.5上，进行继代培养3次，每次时间为2周。(B)农杆菌菌液的准备a)挑取鉴定好的农杆菌单菌落放于5mL含有50mg/L利福平和40mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃250rpm震荡培养至OD600为0.6左右。然后以1:100的比例重新接种到新鲜的LB培养基中振荡培养，LB培养基中所含抗生素和培养条件同前。b)当OD600＝0.6时，将菌液以相对离心力4000×g，4℃离心10min，收集菌体，并按1:1重悬于侵染液中，28℃250rpm震荡培养2h，使菌种充分活化。(当OD600值不是0.6时，要调至0.6)(C)转化水稻愈伤组织a)转化前将水稻愈伤切成0.4～0.5cm大小，并置于NBD2.0培养基上预培养4天。b)将预培养好的愈伤组织浸入含有农杆菌的侵染液中20min后，用无菌滤纸吸干多余的菌体，置于铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，黑暗中培养3天。(D)水稻愈伤组织的抗性筛选a)从共培养培养基上收集愈伤组织，并用含有500mg/L的头孢曲松钠的无菌水冲洗6～7次，吸取多余水分。b)将愈伤组织转入筛选培养基a上培养2周，再移到筛选培养基b上继续筛选2次,每次2周。最后得到鲜黄色的抗性愈伤组织。(E)抗性愈伤的再生a)将获得的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基中培养12～15天。(其中前6～7天黑暗培养，后8～9天光照培养，光照强度为45～55mmol·m-2·s-1)。b)将已分化出不定芽的愈伤组织转移到分化培养基上培养15天，可使不定芽长成3cm左右的小苗。c)将分化的小苗转移到生根培养基中，两周后生根，经过一周左右的炼苗，即可移栽到温室中栽培，待生长一段时间可以移至大田种植。(3)筛选纯合转基因株系首先对Rosea1基因过量表达转基因植株进行了T2代纯合体筛选，具体步骤如下：选取潮本文档来自技高网...

【技术保护点】
花青素合成调控基因Rosea1的应用，其特征在于花青素合成调控基因Rosea1用于提高水稻耐盐耐旱性。

【技术特征摘要】
1.花青素合成调控基因Rosea1的应用，其特征在于花青素合成调控基因Rosea1用于提高水稻耐盐耐旱性；所述花青素合成调控基因Rosea1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯献忠，杨素欣，豆明珠，黄荣峰，
申请(专利权)人：中国科学院东北地理与农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23