一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略制造技术

本发明专利技术提供了一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略。采用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)发酵生产辅酶Q10，提供了辅酶Q10发酵的具体操作方法，建立了工艺调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。

【技术实现步骤摘要】
一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略。
技术介绍
辅酶Q10结合在动植物、微生物细胞内线粒体膜上，是呼吸链一个重要的递氢体，是一种有效的生化药物，具有很多重要的生理作用。多项数据证明辅酶Q10对人类的健康及疾病治疗越来越重要，近期研究发现辅酶Q10具有抗衰老作用，已经广泛应用到化妆品及保健品领域，国内外需求进一步扩大。辅酶Q10的生产方法主要有动植物组织提取法、化学合成法以及微生物发酵法三种。其中动植物提取法成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本也较高，目前国内外大多都是采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点：(1)产品为天然品，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。要提高辅酶Q10发酵产量主要从两个方面进行优化：一是选育出辅酶Q10高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺。确定生产菌株及发酵培养基后，需要对发酵条件进行优化，摇瓶及小罐试验阶段可以通过单因素等其他统计学的方法来进行优化，在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵过程长，发酵结果具有一定的波动性，对最终结果分析造成一定的干扰，影响判断，重复性低，效率低等缺点。本专利技术提供了一种辅酶Q10发酵的具体操作方法，建立了一个工艺参数调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以各个菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，只需观察菌型的变化即可掌握菌型过渡期，恰当的调整发酵工艺参数使菌体正常的过渡到下一个菌型，具有易控性及简便性，波动性小，从而使辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种辅酶Q10工艺及控制策略，建立以菌体在发酵过程中菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间点及调整幅度的技术手段，为辅酶Q10发酵提供最优发酵条件，从而提高辅酶Q10发酵产量。本专利技术步骤如下：1)平板培养配置平板培养基，所述的平板培养基的组分为：葡萄糖2.0～4.0g/L，酵母粉1.0～3.0g/L，蛋白胨1.0～3.0g/L，琼脂粉20～30g/L，消前pH6.8～7.2，于121℃灭菌25～30min。从平板上挑取一个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上涂布，于32～34℃培养5～7天。2)母瓶培养配置母瓶培养基，所述母瓶培养基的组分为：氯化铵1.7～2.5g/L，蛋白胨0.7～1.5g/L，味精0.4～1.2g/L，玉米浆0.4～1.2g/L，葡萄糖2～6g/L，磷酸氢二钠0.35～0.55g/L，磷酸二氢钠0.35～0.55g/L，三氯化铁0.08～0.12g/L，硫酸镁1.4～2.2g/L，氯化钾1.4～2.2g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.2～0.6g/L，苯丙氨酸0.4～1.2g/L，茄尼醇4～8g/L。除辅液I之外于121℃灭25～30min，辅液I于118℃灭20～25min，按体积比0.2～0.6％加到母瓶培养基中。从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h，待残糖为0.5～1.5g/L时按5～10％接种量接入一级种子罐。3)一级种子罐培养配置一级种子培养基，所述的一级种子培养基的组分为：氯化铵2～4g/L，蛋白胨0.8～1.6g/L，味精0.6～1.8g/L，玉米浆0.6～1.8g/L，葡萄糖4.8～9.6g/L，磷酸氢二钠0.4～0.8g/L，磷酸二氢钠0.4～0.8g/L，三氯化铁0.08～0.14g/L，硫酸镁1.6～3.2g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺10～15g/L，核黄素0.5～1.5g/L，吡哆素1.5～2.5g/L，叶酸0.25～0.75g/L，烟酸6～12g/L，烟酸胺6～12g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.2～0.6g/L，茄尼醇3～9g/L。消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4～6.7，除辅液II之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通空气保压，辅液II装容器于118℃灭20～28min。待母瓶残糖＜0.5～1g/L时即可一级移入种子罐，移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进一个耐压的容器，在火焰保护下用差压法由接种口先压入消好的辅液II，再压入母瓶种子液，接种量为5％～10％，辅液II用量为0.4～0.8％，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h。待残糖降至0.5～1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子移入二级种子罐，接种量为5～10％。4)二级种子罐培养配置二级种子罐培养基，所述培养基组分为氯化铵2.6～3.8g/L，蛋白胨1.6～3.2g/L，味精0.6～1.2g/L，玉米浆0.6～1.2g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸氢二钠0.6～1.2g/L，磷酸二氢钠0.6～1.2g/L，三氯化铁0.15～0.25g/L，硫酸镁3～6g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0005～0.0015g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺10～20g/L，核黄素1.5～3g/L，吡哆素2～4g/L，叶酸0.4～1.0g/L，烟酸15～25g/L，烟酸胺15～25g/L，泛酸钙0.001～0.004g/L，苯丙氨酸0.002～0.006g/L，茄尼醇0.04～0.08g/L。消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4～6.7，除辅液III之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭20～25min后降室温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.1～0.4％。二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h待残糖降至0.5～1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子罐移入三级种子罐，接种量为5～10％。5)三级发酵罐培养配置三级发酵培养基，所述培养基组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅酶Q10发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：1)菌种传代：采用平板培养进行菌种传代，从平板上挑取外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落装于有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于32～34℃培养5～7天；2)母瓶培养：从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h；3)一级种子培养：待母瓶残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量5～10％接入一级种子罐中，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；4)二级种子培养：待一级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入二级种子罐，二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；5)三级发酵培养：待二级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入三级发酵罐中，三级发酵罐初始培养条件为0.03～0.035MPa，转速60～70rpm，vvm 0.42～0.46，罐温32～34℃，初始糖浓度10～15g/L，磷浓度0.3～0.4g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制7～12g/L，磷0.2～0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3～6g/L，磷控制0.1～0.15g/L，通过补加液氨控制pH 7.0～7.4；发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48～0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54～0.6，罐压0.035～0.04Mpa，转速提高至75～90rpm，待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6～0.68，罐压为0.45～0.5Mpa，转速提高至95～105rpm，待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52～0.58，罐压降至0.035～0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5～1.5g/L后停止发酵。...

【技术特征摘要】
1.一种辅酶Q10发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种传代：采用平板培养进行菌种传代，从平板上挑取外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落装于有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于32～34℃培养5～7天；
2)母瓶培养：从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h；
3)一级种子培养：待母瓶残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量5～10％接入一级种子罐中，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；
4)二级种子培养：待一级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入二级种子罐，二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；
5)三级发酵培养：待二级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入三级发酵罐中，三级发酵罐初始培养条件为0.03～0.035MPa，转速60～70rpm，vvm0.42～0.46，罐温32～34℃，初始糖浓度10～15g/L，磷浓度0.3～0.4g/L，接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制7～12g/L，磷0.2～0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3～6g/L，磷控制0.1～0.15g/L，通过补加液氨控制pH7.0～7.4；
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48～0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54～0.6，罐压0.035～0.04Mpa，转速提高至75～90rpm，待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm0.6～0.68，罐压为0.45～0.5Mpa，转速提高至95～105rpm，待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52～0.58，罐压降至0.035～0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5～1.5g/L后停止发酵；
其中，采用的菌种为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.4497；
所述的平板培养基组分为：葡萄糖2.0～4.0g/L，酵母粉1.0～3.0g/L，蛋白胨1.0～3.0g/L，琼脂粉20～30g/L，消前pH6.8～7.2，于121℃灭菌25～30min；
所述的母瓶培养基的组分为：氯化铵1.7～2.5g/L，蛋白胨0.7～1.5g/L，味精0.4～1.2g/L，玉米浆0.4～1.2g/L，葡萄糖2～6g/L，磷酸氢二钠0.35～0.55g/L，磷酸二氢钠0.35～0.55g/L，三氯化铁0.08～0.12g/L，硫酸镁1.4～2.2g/L，氯化钾1.4～2.2g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱志春，蒋四富，陈必钦，文昌，张广忠，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司，厦门金达威集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15