一种银包金纳米棒的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种银包金纳米棒的制备方法及应用，属于食品质量检测分析技术领域。本发明专利技术通过制备Au@Ag纳米棒，利用其表面增强荧光性，成功应用于检测大肠致病菌E.coli O157:H7eaeA基因，与传统方法相比，极大的降低了检测限、提高了灵敏度和并获得了良好的稳定性。利用荧光增强-减弱原理，建立了大肠致病菌E.coli O157:H7eaeA基因检测标准曲线，线性范围在10-17-10-11M之间，相关系数为R2＝0.9947，检测限为3.33×10-18M(S/N＝3)。本发明专利技术特异性良好，通过加标实验，eaeA基因回收率为98.36％–101.67％，且其稳定性良好，可应用于水中大肠致病菌E.coli O157:H7eaeA基因的检测，具有非常广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于食品质量检测分析技术领 域。
技术介绍
大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli)为埃希氏菌属（Escherichia)代表菌，是 人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。它侵入人体一些 部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃 痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。 大肠杆菌的致病物质主要是：（1)侵袭力：包括K抗原和定居因子；（2)内毒素： 含有内毒素的大肠杆菌的细胞壁内具有内毒素活性，脂多糖层的脂类A是毒性部位；（3)肠 毒素：肠毒素对热稳定性不同，分为耐热和不耐热两种。不耐热肠毒素对热不稳定，65°C时 30分钟即可失去活性，而耐热性肠毒素对热稳定，KKTC加热20分钟仍不被破坏，分子量较 小，免疫原性弱。所致疾病包括：（1)肠道外感染：多为内源性感染，以泌尿系统感染为主， 如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等；（2)急性腹泻，其中由肠 出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEcoli，EHEC)是指能引起出血性肠炎、溶血性尿毒综 合征的一类大肠杆菌，可产生志贺样毒素。EHEC的主要菌型是0157 :H7,还包括026 :H11、 0111 等。 传统检测检测大肠致病菌E.coli0157:H7的方法：1)常规检测方法：铺板培养 法、计数法、生化检测、显微镜、流式细胞仪和发光法。2)免疫学检测方法：免疫印迹法和酶 联免疫分析法；3)分子生物学检测方法：聚合酶链式反应（PCR)以及DNA微阵列。 然而，传统检测细菌的方法是由形态学表征或者生化分析来完成的，它们不能够 在细菌种类上提供准确的结论以至于不能实现菌株水平上的鉴别以及从环境中分离的细 菌检测；同时试验进行以及数据处理都是非常耗时，不能满足细菌检测所需要的快速、准确 的实时监测。PCR方法受样品影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分 (糖类、酸类、油脂等物质）会干扰反应的正常进行，而检测的环境，中间处理环节也会带来 一些PCR反应抑制剂，从而使PCR呈现较高的假阳性和假阴性率。ELISA虽然具有很高的灵 敏性和可重复性，但也存在致病菌样本量大，操作繁琐，试剂盒价格昂贵，成本高，准确性差 和操作复杂而需专业培训等缺陷。生物传感器方法虽然其稳定性好、精度高，但是普遍存在 仪器价格昂贵的缺点，不能满足大规模样品中致病菌的检测需求，商业化的进展很慢。产志贺毒素大肠杆菌（Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)不仅 能引起人类腹泻，还可引起严重的出血性肠炎（hemorrhagiccolitis，HC)和溶血性尿毒 症（haemolyticuraemicsyndrome，HUS)。尤其是肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage Escherichiacoli，EHEC)0157:H7菌株在报道的感染中占主导地位。eaeA、stx2和hlyA 基因是STEC致病的主要毒力基因，E.coli0157:H7的黏附定植能力是肠出血性大肠杆菌 (EHEC0157:H7)的重要体现，其对上皮细胞的黏附作用与染色体上的eaeA基因有关。对于 大肠致病菌0157 :H7来说，eaeA基因是致病的一个毒力基因之一。如果能够快速、灵敏检 测出大肠致病菌〇157:H7中的毒力基因eaeA，那么就对预防出血性肠炎等疾病具有重要意 义。 本专利技术制备了Au@Ag纳米棒，并利用其表面增强荧光的效应，成功应用于检测大 肠致病菌E.coli 0157:H7eaeA基因。
技术实现思路
针对现有检测大肠致病菌E. coli 0157:H7方法的不足，以及eaeA基因对肠出血 性疾病的毒力作用影响，本专利技术提供了一种用于检测该基因的新方法。首先制备Au@Ag纳 米棒，然后在其表面修饰寡核苷酸探针，再与荧光染料cy3连接的部分核苷酸杂交，构建了 检测大肠致病菌E. coli 0157:H7eaeA基因的生物传感器。本专利技术结合Au@Ag纳米棒具有好 的单分散性以及长度的可调控性，在紫外和近红外区有宽的等离子吸收，且比Au纳米棒有 尖而强的纵向等离子体振动谱带等特点，利用表面增强荧光的效应，首次建立了Au@Ag纳 米棒检测大肠致病菌eaeA基因的生物传感器，具有低检测限、高灵敏度、稳定性好等特点。 本专利技术的第一个目的是提供一种银包金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述 方法是：将利用种子生长法制备好的金纳米棒溶液和CTAB溶液混合后，向其中依次加入 AgN03溶液、抗坏血酸溶液、NaOH溶液于25-30°C下过夜。 所述方法包括：在每20ml浓度为0. 02-0. 08mol/L的CTAB溶液中，添加10-20mL 浓度为15_30nmol/L的金纳米棒溶液，搅拌，依次添加1000-4000 yL浓度为2-8mmol/L 的AgNCV^液、500-800 y L浓度为0. 1-0. 5mol/L的抗坏血酸溶液、1000-3000 y L浓度为 0. 1-0. 5mol/L的NaOH溶液，搅拌、静置，即合成得到Au@Ag纳米棒。 所述方法合成的Au@Ag纳米棒，在本专利技术的一种实施方式中，分别选择了不同长 度的金纳米棒，从而分别合成长度为30nm，40nm，50nm的Au@Ag纳米棒。 所述方法合成得到的长度分别为30nm、40nm、50nm的Au@Ag纳米棒所使用的AgN03 溶液的体积分别是1250yL，2500yL和3750yL。 本专利技术的第二个目的是提供一种按上述方法得到的Au@Ag纳米棒。 本专利技术的第三个目的是提供一种所述Au@Ag纳米棒的应用方法。 所述应用方法，在本专利技术的一种实施方式中是用于检测eaeA基因。 所述方法，是在Au@Ag纳米棒上修饰寡核苷酸探针，寡核苷酸探针与焚光染料cy3 连接的部分核苷酸杂交后，荧光信号增强。当目标DNA出现时，探针与目标DNA结合，此时 荧光减弱，从而根据荧光增强-减弱原理将其应用于大肠致病菌E. coli 0157:H7eaeA基因 的检测。 所述方法包括：（1)在Au@Ag纳米棒表面上修饰寡核苷酸探针，然后与加入荧光染 料cy3修饰的核苷酸进行杂交，得到修饰好的Au@Ag-DNA杂交溶液；（2)测定步骤1得到的 杂交溶液上清液的荧光强度FAg; (3)将不同浓度的目标基因序列加入到步骤1制备的Au@ Ag-DNA杂交上清液中，反应、离心、测定上清液的荧光强度Fs，最后根据公式FAg-Fs/FA# 算荧光强度的变化得到不同浓度目标基因加入后荧光强度的变化值FAg-Fs/FAg; (4)绘制目 标基因浓度与荧光强度变化值的标准曲线；（5)将待测样品添加到步骤1制备的杂交溶液 中，测定荧光强度，然后根据公式算荧光强度的变化值，最后根据步骤4得到的 标准曲线，计算待测样品中目标基因的浓度。 所述步骤（1)中Au@Ag纳米棒，在本专利技术的一种实施方式中，是采用长度为50nm 的AuOAg纳米棒。 所述步骤（1)中寡核苷酸探针，在本专利技术的一种实施方式中，是5'-H2N-C6-GCGAGG AACGCCGATAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种银包金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述方法是：将利用种子生长法制备好的金纳米棒溶液和CTAB溶液混合后，向其中依次加入AgNO3溶液、抗坏血酸溶液、NaOH溶液于25‑30℃下过夜。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，孙嘉笛，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32