靶标检测和信号放大制造技术

本发明专利技术涉及用于检测靶标分子以及放大通过检测测定产生的可检测信号的组合物和方法。更具体来说，本发明专利技术涉及利用催化核酸酶来产生和/或放大指示存在靶标分子(例如核酸和蛋白质)的信号的方法以及用于所述方法中的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶标检测和信号放大以交叉引用的方式并入本申请要求2012年6月18日提交的澳大利亚临时专利申请号2012902551、2012年8月10日提交的澳大利亚临时专利申请号2012903462，及2013年4月3日提交的澳大利亚完整专利申请号2013202354的优先权，各案的完整内容以交叉引用的方式并入本文。
本专利技术涉及用于检测靶标分子以及放大通过检测测定产生的可检测信号的组合物和方法。更具体来说，本专利技术涉及利用催化核酸酶来产生和/或放大指示存在靶标分子(例如核酸和蛋白质)的信号的方法以及用于所述方法中的组合物。背景许多测定当前可用于检测样本中的靶标分子。一些依赖于使用酶，并且特别是催化对核酸进行修饰的酶，包括以下论述的下列酶。核酸酶核酸酶是裂解在核酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。脱氧核糖核酸酶作用于DNA，而核糖核酸酶作用于RNA，不过，有一些核酸酶利用DNA与RNA两者作为底物。核酸酶可被进一步分类为核酸内切酶和核酸外切酶，但一些酶可具有多种功能，并且同时展现核酸内切酶活性与核酸外切酶活性。核酸内切酶裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键。相比之下，核酸外切酶裂解在多核苷酸链末端的磷酸二酯键。核酸外切酶可自DNA或RNA链的5’端或3’端，或自两端移除核苷酸。蛋白质核酸外切酶的非限制性实例包括核酸外切酶I(大肠杆菌(E.coli))、核酸外切酶III(大肠杆菌)、核酸外切酶VII和T7核酸外切酶。核酸外切酶III(ExoIII)是催化自3’钝端或3’凹入的双链体DNA逐步移除单核苷酸的一种核酸外切酶。所述酶还能够在双链体DNA内的切口处起作用。ExoIII对具有至少4nt的单链突出端的单链DNA或双链体DNA具有极小活性。催化核酸酶催化核酸酶是能够修饰特定底物的非蛋白质酶。催化核酸酶包括DNA分子(在本领域中也称为DNA酶(DNAzyme)、脱氧核糖酶或DNA酶(DNAenzyme))、RNA分子(在本领域中也称为核糖酶)以及主要由多个DNA和/或RNA分子组成的多组分核酸酶(在本领域中也称为MNA酶)。催化核酸酶可通过例如裂解或连接来修饰特定核酸底物序列。一类独特的催化核酸酶(在本领域中称为辣根过氧化物酶模拟性DNA酶)可催化将特定化学底物转化成它们的氧化产物的过氧化物酶反应，所述产物可例如产生颜色变化或发射荧光或化学发光信号。能够裂解或连接RNA底物、DNA底物和/或嵌合DNA/RNA底物的DNA酶和核糖酶通常可仅修饰满足最小序列要求的靶标核酸底物。举例来说，底物应与酶的底物结合臂展现足够的碱基对互补性，并且还需要在催化修饰的位点处具有特定序列。此类在催化裂解位点处的序列要求的实例包括对于供DNA酶裂解的嘌呤:嘧啶序列(10-23模型)的要求以及对于供锤头状核糖酶用的序列尿苷:X的要求，其中X可等于A、C或U但非G。10-23DNA酶是能够在特定RNA磷酸二酯键处裂解核酸底物的DNA酶。这种DNA酶具有侧接两个底物识别结构域(臂)的含15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域。MNA酶是另一种类的催化核酸酶。这些多组分核酸酶需要装配促进剂(assemblyfacilitator)(例如靶标核酸)来实现它们的装配和催化活性。MNA酶主要由多种部件酶(part-enzyme/partzyme)组成，这些部件酶在一种或多种装配促进剂存在下进行自装配，并且形成了能够催化修饰底物的催化活性MNA酶。部件酶具有多个结构域，包括结合装配促进剂(如靶标核酸)的感应臂(sensorarm)；结合底物的底物臂；和部分催化核心序列，这些序列在多种部件酶组分装配时组合以提供完整的催化核心。MNA酶可被设计用来识别众多的装配促进剂，包括例如不同靶标核酸序列。在装配促进剂存在下，催化活性MNA酶可由部件酶组分装配，接着结合并催化修饰底物以产生输出信号。装配促进剂可为生物或环境样本中存在的靶标核酸。在所述情况下，MNA酶催化活性指示存在靶标。已报道若干能够裂解核酸底物的MNA酶，并且其它可连接核酸底物的MNA酶在本领域中也是已知的。适配酶(Aptazyme)是特定类型的催化核酸(DNA酶、核糖酶或MNA酶)，这些核酸已与适体结构域连接以对核酸酶进行别构调控，从而使它们的活性取决于存在能够结合所述适体结构域的靶标分析物/配体。已使用互补调控寡核苷酸，通过结合适配酶内的适体与一部分催化核酸结构域两者以在不存在靶标分析物下抑制适配酶的活性。通过靶标配体与适体部分结合，由此促进调控寡核苷酸的移除，可逆转对适配酶催化活性的抑制。本专利技术者没发现先前有采用以下寡核苷酸的方法的任何公开内容：所述寡核苷酸被设计用来可逆抑制未与适体偶联的催化核酸(即，不是适配酶的催化核酸)的催化活性对核酸底物的修饰，其中抑制作用是由结合催化核酸的催化核心或其一部分的寡核苷酸介导的。链置换聚合酶(Stranddisplacingpolymerase)DNA聚合酶催化脱氧核糖核苷酸聚合形成DNA链。它们是负责DNA复制的天然存在的酶，其中聚合酶“阅读”作为模板的完整DNA链，并且使用它来合成新链。一些DNA聚合酶含有5’-3’校对核酸外切酶活性，借此它们将降解在合成期间遇到的任何下游链(例如TaqDNA聚合酶)。相比之下，链置换DNA聚合酶能够置换在合成期间遇到的任何下游链。这些下游链不被降解，并且保持完整。链置换DNA聚合酶的实例包括Phi29、DNA聚合酶I克林诺片段(KlenowFragment)、VentR和Bst聚合酶大片段。激酶和磷酸酶激酶可催化γ-磷酸自ATP转移至蛋白质中的特定氨基酸以及核酸末端。磷酸酶可催化通过水解酯化的磷酸来移除磷酸基团，从而产生磷酸根离子和具有游离羟基的分子。通过激酶进行的蛋白质磷酸化和通过磷酸酶进行的脱磷酸化对于调控细胞内的信号转导路径很重要，由此在如代谢、细胞周期进程、细胞移动和细胞凋亡等细胞过程中起关键作用。在分子生物学中，寡核苷酸3’末端的磷酸化可用作防止它们被聚合酶延伸的方法。或者，寡核苷酸3’末端的脱磷酸化可用作使它们被聚合酶延伸的方法。靶标扩增和信号放大技术为增加靶标检测的灵敏度，已采用使靶标扩增或信号放大的策略，其中有许多利用了DNA和/或RNA聚合酶。采用靶标扩增的现存方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录物介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。依赖于链置换扩增的那些方法(例如SDA、RCA和LAMP)需要使用具有链置换活性的聚合酶。也已描述了利用包括切口核酸内切酶在内的核酸酶的信号放大级联(例如NESA)。也已描述利用催化核酸的信号放大级联。一个实例涉及使用一种通过核糖核苷酸接点接合两个邻近的过氧化物酶模拟性DNA酶组成的寡核苷酸。这种寡核苷酸的末端是通过与各末端杂交的短接头DNA连接在一起，由此形成准环状结构。这一结构的形成会暂时抑制DNA酶的催化活性。在靶标装配促进分子存在下装配的MNA酶直接与DNA酶杂交，并且裂解它们之间的核糖核苷酸接点。裂解含有所述寡核苷酸的DNA酶会使两种DNA酶彼此分开，并且与短接头DNA分开，从而导致DNA酶活化。这一策略的局限是信号放大仅限于因每一MN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，包含：(i)第一分子复合物，包含：第一催化核酸酶；或其催化部分；或与所述酶或所述其催化部分互补的核苷酸序列；通过互补碱基配对与第一阻断寡核苷酸(BL)杂交，其中至少一个：所述第一酶或所述其催化部分的催化核心核苷酸，或所述序列的与催化核心核苷酸互补的核苷酸与所述第一BL杂交，并且所述第一催化核酸酶不是适配酶；以及(ii)能够由所述第一催化核酸催化修饰的核酸底物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.18 AU 2012902551;2012.08.10 AU 2012903462;1.一种组合物，其包含：(i)第一分子复合物，其包含第一催化核酸酶或其催化部分，和第一阻断寡核苷酸，所述第一催化核酸酶或其催化部分通过互补碱基配对与所述第一阻断寡核苷酸杂交，其中：所述第一阻断寡核苷酸包含第一区段和第二区段以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；所述第一区段和第二区段通过互补碱基配对分别与所述第一催化核酸酶或其催化部分的不同杂交臂杂交，所述中间区段包含第二催化核酸酶的底物，并且所述底物中至少一段不与所述第一催化核酸酶或其催化部分杂交；所述第一催化核酸酶或其催化部分的至少一个催化核心核苷酸与所述第一阻断寡核苷酸杂交，并且所述第一催化核酸酶不是适配酶；(ii)能够由所述第一催化核酸酶或其催化部分催化修饰的核酸底物，以及(iii)引发催化核酸酶，其中所述引发催化核酸酶选自MNA酶，与适体结构域连接的核糖酶，和与适体结构域连接的DNA酶，并且能够以靶标依赖性方式通过裂解催化修饰中间区段的底物。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述引发催化核酸酶是适配酶。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述中间区段包含第一底物和第二底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第一催化核酸酶或其催化部分杂交。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述中间区段的任何所述底物都包含限制酶的部分识别位点。5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述第一阻断寡核苷酸；所述第一催化核酸酶或其催化部分，或所述核酸底物中的任一种被栓系于不溶性载体。6.根据权利要求3所述的组合物，还包含第二分子复合物，所述第二分子复合物包含第二催化核酸酶和第二阻断寡核苷酸，所述第二催化核酸酶通过互补碱基配对与第二阻断寡核苷酸杂交，其中：所述第二阻断寡核苷酸包含各自通过互补碱基配对与所述第二催化核酸酶的不同杂交臂杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间的中间区段；所述中间区段包含所述第一底物的拷贝和第三底物，并且每一所述底物中至少一段不与所述第二催化核酸酶杂交；并且所述第一催化核酸酶能够杂交和裂解所述第三底物，并且所述第二催化核酸酶能够杂交和裂解所述第二底物。7.一种试剂盒，包括根据权利要求1至6中任一项所述的组合物。8.至少一种分子复合物、第一引发酶和报道底物在制备用于检测样本中存在或不存在第一靶标分子的药物中的用途，其中所述至少一种分子复合物包含阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶，所述阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一催化核酸酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含第二催化核酸酶的第一底物的中间区段，其中所述第一底物中至少一段不与所述第一催化核酸酶杂交；其中所述第一引发酶对所述第一靶标分子以及所述中间区段的所述第一底物具有结合特异性，并且所述第一靶标分子与所述第一引发酶的杂交诱导所述第一引发酶的催化活性，由此促进所述第一底物在与所述第一引发酶杂交时的裂解；所述第一底物的裂解导致所述分子复合物中所述阻断寡核苷酸和所述第一催化核酸酶的杂交链解离；并且所述分子复合物的所述第一催化核酸酶对所述报道底物具有结合特异性，并且在所述解离之后能够与所述报道底物杂交并将其裂解，由此提供指示所述样本中存在所述第一靶标分子的可检测信号；其中所述第一引发酶是核糖酶、DNA酶、或MNA酶。9.如权利要求8所述的用途，其中所述第一引发酶是适配酶。10.如权利要求8所述的用途，其中所述第一引发酶是适配MNA酶。11.一种用于检测样本中存在或不存在第一靶标分子的方法，所述方法包括：(a)使所述样本与以下各物接触：至少一种包含第一阻断寡核苷酸和第一催化核酸酶的分子复合物，所述第一阻断寡核苷酸包含通过互补碱基配对与所述第一催化核酸酶杂交的第一区段和第二区段，以及在所述第一区段与所述第二区段之间并且包含第二催...

【专利技术属性】
技术研发人员：西蒙·马克·伯恩，艾莉森·威尔彦·托德，蒂莫西·丹尼尔·米罕，
申请(专利权)人：斯比戴克斯私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU