一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法技术

本发明专利技术公开了一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，属于黄酒生产工艺领域。本发明专利技术是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量，根据MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白是否与混浊敏感蛋白一致，并通过凯氏定氮法测定酒体中蛋白质减少的量，从而评价混浊敏感蛋白是否得到去除以及去除的效果大小。该方法可以直接、准确的评价澄清剂对混浊敏感蛋白的去除效果。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于黄酒生产工艺领域。本专利技术是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量，根据MALDI-TOF/TOF MS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白是否与混浊敏感蛋白一致，并通过凯氏定氮法测定酒体中蛋白质减少的量，从而评价混浊敏感蛋白是否得到去除以及去除的效果大小。该方法可以直接、准确的评价澄清剂对混浊敏感蛋白的去除效果。【专利说明】
本专利技术涉及，属于黄酒生产工 艺领域。
技术介绍
在黄酒的沉淀物中，蛋白质占有较大的比例，一般在30%?50%。然而黄酒稳定 性与蛋白质总量没有直接的因果关系，可能与酒中的某类蛋白质呈正相关，我们称此类蛋 白为混浊敏感蛋白，去除混浊敏感蛋白将是提高黄酒稳定性的的最佳途径。因此，一种能够 准确、直接评价混浊敏感蛋白去除效果的方法就尤为重要。 目前应用比较广泛的评价黄酒非生物稳定性的方法有：自然存放法、低温存放法 和强制老化法。这些方法间接地反映了混浊敏感蛋白的多少。自然存放法当然是最准确反 映黄酒非生物稳定性的方法，它是将酒在自然条件下长期存放，肉眼判断其出现沉淀时间 的长短和沉淀量的多少，但是，自然存放法实验周期长，并且判断方法随意，不便于实验研 宄；低温存放法是在较低的温度下存放一段时间后比较其冷浑浊的情况；强制老化法则是 通过冷热胶体的方法促进黄酒混浊的形成，相当于快速的自然存放。这些预测方法都可以 一定程度的反映出黄酒稳定性的好坏，但是每一种方法实施的具体时间和温度非常随性， 缺乏一个比较统一的标准。
技术实现思路
本专利技术利用离心、盐析、透析、真空冷冻干燥制备混浊蛋白和澄清剂吸附蛋白样 品，并且利用Tricine-SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOFMS技术分析蛋白质分子量分布及种类，通 过比较两者是否一致来确定混浊敏感蛋白是否得到特异性去除，并且通过凯氏定氮法分析 混浊敏感蛋白减少的量。 本专利技术的目的是提供一种能够客观、直接、准确评价黄酒混浊敏感蛋白的去除效 果的方法。 本专利技术所述混浊敏感蛋白是指：将黄酒自然存放出现的混浊沉淀中的总的蛋白， 统称为混池敏感蛋白。 本专利技术提供，是先向黄酒中添 加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用TriCine-SDS-PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清 剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI-TOF/TOFMS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清 剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量。 所述评价方法是指如果MALDI-TOF/TOFMS鉴定结果表明混浊敏感蛋白与澄清剂 吸附的蛋白的种类一致，说明混浊蛋白得到特异性去除，反之没有，同时根据总氮含量降低 的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。 所述收集澄清剂吸附的蛋白是指离心经澄清剂处理的黄酒，收集沉淀、洗涤沉淀、 氨水溶解沉淀，离心去除澄清剂后于上清中添加硫酸铵来沉淀蛋白，将沉淀悬浮、脱盐透 析、冷冻干燥，得到的蛋白质样品即为澄清剂吸附的蛋白。 所述氨水溶解沉淀，在本专利技术的一种实施方式中，是采用体积分数〇. 1% -2%的 氨水进行溶解。 所述氨水溶解沉淀，在本专利技术的一种实施方式中，是选用体积分数2 %的氨水进行 溶解。 所述氨水溶解沉淀，在本专利技术的一种实施方式中，加入氨水的体积为沉淀体积的 3-5倍。 所述硫酸铵来沉淀蛋白，在本专利技术的一种实施方式中，是缓慢添加硫酸铵至饱和 度达到60% -100%。 所述脱盐透析，在本专利技术的一种实施方式中，是采用截留分子量为1000?8000Da 的透析袋进行脱盐透析。 所述离心，在本专利技术的一种实施方式中，是指黄酒添加澄清剂后静置2?5天，倾 去上层清液，然后在相对离心力为8000?17800g下，离心10?30min。 所述使用Tricine-SDS-PAGE技术，在本专利技术的一种实施方式中，先将采用 Bradford法测定澄清剂吸附的混池蛋白浓度。 所述Tricine-SDS-PAGE技术，在本专利技术的一种实施方式中，使用的分离胶浓度为 16%，浓缩胶浓度为5%。 所述与澄清剂吸附的蛋白进行比较的混浊敏感蛋白，在本专利技术的一种实施方式 中，其获取方式是：黄酒自然存放至出现混浊沉淀，收集沉淀物、洗涤沉淀、氨水溶解沉淀， 然后用硫酸铵沉淀蛋白后经脱盐透析、冷冻干燥，即得到混浊敏感蛋白样品。 所述评价方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体包括： (1)向黄酒中添加澄清剂，静置2?5天后，倾去上层清液，将剩下的黄酒用力与沉 淀混勾，在相对离心力为8000?17800g时离心10?30min，收集沉淀； (2)用3?5倍体积的去离子水洗涤沉淀，离心收集沉淀，再用3?5倍体积的2% (V/V)氨水溶解澄清剂吸附的蛋白； (3)离心除去澄清剂，向上清液中缓慢添加硫酸铵直至饱和度达到80%，离心收 集沉淀； (4)将沉淀悬浮于3?5倍体积的去离子水中，将混悬液盛入截留分子量为 1000?SOOODa的透析袋进行脱盐透析，冷冻干燥，得到蛋白质样品； (5)将得到的蛋白质样品溶于蛋白裂解液，Bradford法测定混池蛋白浓度，通过 Tricine-SDS-PAGE技术分析黄酒混池蛋白质和澄清剂吸附的蛋白质分子量分布； (6)然后利用MALDI-T0F/T0FMS技术鉴定澄清剂吸附的蛋白是否与混浊敏感蛋 白一致，从而评价混浊敏感蛋白是否得到特异性去除； (7)利用凯氏定氮法测定黄酒酒体中的总氮含量，并且根据总氮含量降低的量来 衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。 本专利技术还提供一种黄酒澄清剂的选择方法，是根据上述评价方法来判断一种以上 澄清剂对黄酒混浊敏感蛋白的特异性去除效果，选择相对效果最好的澄清剂。 本专利技术提供了一种能客观、直接、准确评价黄酒混浊敏感蛋白去除效果的方法，为 黄酒蛋白质浑浊的控制和澄清剂的选择工作奠定了基础。 【专利附图】【附图说明】 图1 :混浊敏感蛋白与澄清剂吸附蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M代 表Marker，泳道1为-混池敏感蛋白，泳道2?5分别代表使用娃胶1、单宁、PolyclarK Brewbrite、娃胶2吸附的蛋白，al?a5代表类燕麦蛋白，bl?b5代表二聚α-淀粉酶抑 制剂。 【具体实施方式】 实施例1 (1)单宁处理样品 先将单宁配制成1 %单宁溶液，然后向待澄清酒样中添加单宁溶液，使最终单宁浓 度达到70mg/L，搅拌混匀，静置五天后，取上清过滤，灌装。收集下层沉淀，用2 %氨水溶解 后，缓慢添加硫酸铵使其相对饱和度达到80 %，混合搅拌形成沉淀，离心收集沉淀后，透析 脱盐，冷冻干燥得到单宁吸附蛋白样品。 (2)混浊敏感蛋白收集 未添加单宁的酒样自然存放一段时间，直至出现混浊沉淀，离心收集沉淀物，再将 沉淀物悬浮于超纯水，离心，重复上述过程，收集沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄酒混浊敏感蛋白特异性去除效果的评价方法，其特征在于，所述方法是先向黄酒中添加澄清剂、收集澄清剂吸附的蛋白，使用Tricine‑SDS‑PAGE技术比较混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的分子量的分布，然后使用MALDI‑TOF/TOF MS技术鉴定混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类，最后利用凯氏定氮法测定澄清剂处理前后的黄酒酒体总氮含量；所述评价方法是指如果MALDI‑TOF/TOF MS鉴定结果表明混浊敏感蛋白与澄清剂吸附的蛋白的种类一致，说明混浊蛋白得到特异性去除，反之没有，同时根据总氮含量降低的量来衡量澄清剂对混浊敏感蛋白去除效果的大小。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙军勇，陆健，樊世英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32