本发明专利技术公开了一种用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，该方法利用pH=8的1×TE buffer、10%Tween80和10 mM的焦磷酸钠进行土壤悬浮液的制备；利用流式细胞仪测定样品DNA荧光强度；流式细胞仪上样样品的制备及土壤中的噬菌体丰度快速分析。在FL1-H和SSC-H散点图上圈定噬菌体范围，根据圈定的噬菌体范围，计算噬菌体占总微生物量的比例。本发明专利技术的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，该方法利用pH=8的1×TE buffer、10%Tween80和10 mM的焦磷酸钠进行土壤悬浮液的制备；利用流式细胞仪测定样品DNA荧光强度；流式细胞仪上样样品的制备及土壤中的噬菌体丰度快速分析。在FL1-H和SSC-H散点图上圈定噬菌体范围，根据圈定的噬菌体范围，计算噬菌体占总微生物量的比例。本专利技术的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。【专利说明】
本专利技术涉及一种测定土壤中噬菌体丰度的方法，特别是，属生物
，专用于土壤中噬菌体丰度的快速鉴定。
技术介绍
噬菌体在自然环境中数量巨大，在调节微生物种群的结构与多样性、促进微生物间遗传物质的传递与协同进化、参与微食物环的形成等方面发挥重要角色。噬菌体对宿主菌的每一次感染都潜在着将新的遗传信息导入宿主菌的可能。不论是在实验室还是自然界环境中，越来越多的证据表明在微生物群落的生态和进化过程中细菌和噬菌体共同进化是关键驱动因素。 噬菌体作为微食物环中重要的成分，对传统意义“微生物食物环”中的主要成分均有相当程度的影响，它使得微生物食物环变得更加复杂。病毒可在各式各样的环境中存在，是自然环境中重要而完整的部分。而病毒丰度的变化往往与环境中的温度、元素等其他因素相关联。在摸索并建立起病毒丰度与环境的相应规律后，也可以通过病毒来对环境变化进行指示。 由于病毒体积微小，多数病毒直径在20-200 nm之间。而传统方法一般是将土样制备成悬浮液后，分别用直接过滤除菌和切向流的膜浓缩样品的方法分别获得细菌液和混合病毒液，超速离心后将病毒和细菌在金属网格上进行负染，利用透射电镜观察病毒样颗粒和细菌形态，按形态分类统计后计算噬菌体丰度。还有利用SYBR-Green I荧光染料对超速离心后的病毒和细菌浓缩液染色，在荧光显微镜下对病毒样颗粒和细菌颗粒计数，测定非培养条件下噬菌体和细菌总数，但是估算计数的精度不够高，误差较大，重复性较差。对于可培养的噬菌体大多采用测定效价来计算噬菌体的丰度，而自然界中可培养的微生物种类不到1%，而且可培养噬菌体丰度的测定必须基于宿主细菌的分离培养，因此成本高、时间久。 根据相关文献，流式细胞仪测定噬菌体丰度的主要原理是使特异性核酸荧光染料与噬菌体的核酸物质相结合，根据其在流式细胞仪上所显示出的侧向散射光(与大小有关)和绿荧光(与核酸含量有关)信号来进行区分及计数。流式细胞仪作为一种以单细胞为对象的检测技术，其优势在于能快速分析大量细胞，并获取数据易于进行多元数据分析，还能检测低浓度下的细胞数量，检测下限与灵敏度都得以提高，准确性提高，误差减小，具有快速、客观准确、重复性好，可同时测定多个指标等优点，在医学临床研究中的应用十分广泛，但在土壤微生物尤其是噬菌体丰度测定中的应用相对较少，且先前相关报道得知处理土样的方法只是用无菌水进行溶解离心和过膜的简单处理，存在较大误差与不稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供，针对现有的传统方法估算计数的精度不够高的问题，将流式细胞仪应用于噬菌体丰度的测量，分析噬菌体丰度与水文参数间的关系，初步建立测量方法，从而更好的揭示环境微生物中生物群落结构关系；根据此前相关文献处理土样的方法只是用无菌水进行溶解离心和过膜的简单处理，存在较大误差与不稳定性，所以在土样处理过程中，通过分别添加TweenSO和焦磷酸钠逐步摸索条件并做了进一步优化，最后测得同时添加TweenSO和焦磷酸钠测得的噬菌体丰度更高，而且更加准确，从而更加真实的反应环境中噬菌体的丰度，为进一步了解病毒在微生物食物环乃至整个海洋生态系统中的地位及其在生物地球化学循环中的作用提供了便利。 本专利技术利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，包括以下步骤: (1)称取1~10g 土样，加入10-30 ml经过0.02 um滤膜过滤的pH=8的TE buffer,涡旋震荡1~10 min后，加入体积百分比10~15%的Tween80 50-100 μ 1U-10 mM的焦磷酸钠l~10ml，充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，离心前充分震荡，1000-1500 g离心1~5 min, 2500-3000 g进行二次离心1~10 min，上清液经过布氏漏斗过滤，收集滤液；按终浓度为I μ g/ml的比例向滤液中加入DNAse I (脱氧核糖核酸酶I)和RNAse A(核糖核酸酶A)，在37°C或室温中消化30 min后，按样品终浓度为0.5%(v/v)的比例在分装有样品的冻存管中加入质量百分比浓度为25%的戊二醛，4°C避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于-80°C保存； (2)用滤过的pH=8 的 TE buffer 将 10000X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 分别稀释到100XSYBR GoldUOOXSYBR Green I，将步骤(I)样品取出后，37°C水浴解冻，按终浓度为0.5X染液的比例将100X染液加入到步骤(I)样品中，常温避光染色5 min后，80°C水浴锅中孵育10 min，避光冷却到室温；流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC-H和通道FLl-H进行检测；(3)测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道通畅，喷嘴清洁；将已染色的样品进行上样，在分析软件中建立SSC-H/FL1-H散点图，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光FLl-H和侧向角散射光SSC-H，进样量设定在散点图上持续打出10000个点，在SSC-H/FL1-H散点图上根据核酸含量圈定噬菌体范围(0~102数量级)，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体范围(0~102数量级)和计数。 所述pH=8的IXTE buffer配制如下: I M Tris-HC:取121.1 g Tris，加浓盐酸约42 ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调pH=8.0 ； 0.5 M EDTA (pH8.0) (IL):186.1 g Na2EDTA.2H20，用 NaOH 调 pH 至 8.0，高温高压灭囷，室温保存； 10ΧΤΕ Buffer (ρΗ8.0) (I L):1M Tris-HCl (ρΗ7.4，7.6，8.0)取 100 ml,0.5 M EDTA(ρΗ8.0)取20 ml，高温高压灭菌，室温保存。 IXTE缓冲液用10XTE缓冲液稀释10倍即可。 本专利技术将流式细胞仪技术应用于土壤噬菌体丰度的测定，建立了土壤噬菌体量监测分析的体系；与现有技术相比，有益效果是:(O克服了可培养方法成本高、时间长、数据有限的缺点；(2)比荧光显微镜法更加准确，更加快速；(3)对土壤前期处理方法进行了优化，土壤样品经TweenSO和焦磷酸钠同时处理测得的噬菌体丰度明显高于其他处理方法；总之，本专利技术的方法准确性高，重复性好，制样简单，操作简捷快速，I?3min就可以测定样品丰度，可节省大量的人力、物力和财力。同时我们对土壤样品采用TweenSO和焦磷酸钠分别和同时处理，进一步证明土壤样品在TweenSO和焦磷酸钠同时处理本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）称取1~10 g土样，加入10~30 ml 经过0.02 μm滤膜过滤的pH=8的TE buffer，涡旋震荡1~10 min后，加入体积百分比10~15%的Tween80 50~100μl、1~10 mM的焦磷酸钠1~10ml，充分震荡混匀后超声30~45s，停止30~60s，重复3~5次，离心前充分震荡，1000~1500 g离心1~5 min，2500~3000 g进行二次离心1~10 min，上清液经过布氏漏斗过滤，收集滤液；按终浓度为1μg/ml的比例向滤液中加入DNAse I和RNAse A，在37℃或室温中消化30 min后，按样品终浓度为0.5% v/v的比例在分装有样品的冻存管中加入质量百分比浓度为25%的戊二醛，4℃避光固定15~20 min后，放入液氮迅速冷冻后，于‑80℃保存；（2）用滤过的pH=8的TE buffer将10000×SYBR Gold和10000×SYBR Green I分别稀释到100×SYBR Gold、100×SYBR Green I，将步骤（1）样品取出后，37℃水浴解冻，按终浓度为0.5×染液的比例将100×染液加入到步骤（1）样品中，常温避光染色5 min后，80℃水浴锅中孵育10 min，避光冷却到室温；流式细胞仪检测时，选择侧向角SSC‑H和通道FL1‑H进行检测；（3）将已染色的样品进行上样，在分析软件中建立SSC‑H/FL1‑H散点图，调整并确定流式细胞仪的前向角散射光FL1‑H和侧向角散射光SSC‑H，进样量设定在散点图上持续打出10000个点，在SSC‑H/FL1‑H散点图上根据核酸含量圈定噬菌体范围，通过与BD流式细胞仪相连的WinMDI 2.9计算机分析软件分析散点图上噬菌体范围和计数。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏云林，孙策，季秀玲，李珊，林连兵，张琦，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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