一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株及其分离筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株及其分离筛选方法，本发明专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株的名称为肠杆菌Enterobacter sp，保藏编号为CGMCC NO.9795。本发明专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株具有良好的重金属抗性镉耐受浓度达1800mg/l，并且本发明专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株的分离筛选方法对仪器要求低，操作简单，安全快捷。本发明专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株对矿区受污染土壤修复具有重要的意义，具有重大的社会和经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及土壤修复
，尤其涉及一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株及其分离筛选方法。
技术介绍
江西赣南素有“世界钨都”之名，钨矿众多。在开采钨资源的同时，也给矿区及当地生态系统留下了一些生态问题，如钨矿尾矿石、尾矿砂等的压占耕地，破坏地表景观与植被，尤其是钨矿开采过程中伴生的镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)等污染物给当地土壤和水资源带来严重的重金属污染。生物修复被认为是一种来源广泛、处理费用低、无污染且修复效率高的方法,特别是微生物修复技术越来越受到学者的青睐。修复重金属污染的微生物主要是土著真菌和细菌，不同微生物对重金属污染的耐性也不同，通常为真菌>细菌>放线菌。污染土壤中的土著微生物往往具有较高的重金属抗性,从中分离的微生物由于适应当地的自然环境,所以能有效修复重金属污染。但是目前还没有报道有很好重金属抗性的菌株，所以寻找一种高重金属抗性的菌株，就对土壤修复和环境保护具有重要的意义。
技术实现思路
基於此,本专利技术提供了一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株及其分离筛选方法，采用稀释平板分离法从矿区重金属镉(Cd)污染土壤中分离、筛选出耐高浓度Cd(耐受浓度达1800mg/l)微生物菌株E,通过16SrRNA系列分析得知,该菌株为阴沟大肠杆菌Enterobacter sp。本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株的名称为肠杆菌Enterobacter sp；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年10月17日；保藏编号为CGMCC NO.9795。本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株的分离筛选方法的具体步骤如下：(1)土样采集：采集矿区土壤表层下0～20cm处的土样，然后加水制得土样稀释液；(2)耐镉菌株的分离与纯化：用无菌移液管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4各土样稀释液0.2mL于Cd2+浓度为10mg/L、30mg/L、60mg/L的3种浓度培养基的平板中，用无菌玻璃棒涂布均匀，每个浓度、每个梯度平行做3个，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d，分离后长出的单菌落用接种环分别挑取少许置于Cd2+浓度60mg/L的同种培养基上，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d，待菌落长出后，检查其特征是否一致，同时将其进行镜检，是否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯种培养；(3)Cd抗性菌株的高浓度筛选：将纯化所得菌株依次接种到含Cd2+浓度分别为60～1800mg/L的系列浓度梯度的同种培养基上，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d，挑选出抗高浓度Cd2+的菌株，得到本专利技术的超高浓度耐镉菌株。步骤(1)中，采集矿区土样中，选取有代表性的污灌区且微生物数量多、种类丰富的菜地或滩涂采集土样(长期用上游为矿山排水沟的污染水源浇灌)，因土样中的微生物已经过特定环境自然筛选。而后用于筛选的土壤经ICP检测Cd2+含量达5.07mg/kg。步骤(2)和步骤(3)中，所述的马铃薯培养基的组成如下：每1000ml水中含有：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g；牛肉膏蛋白胨培养基的组成如下：每300ml水中含有：牛肉膏1.5g、蛋白胨3g、NaCl1.5g；培养基的pH值为7.0～7.5。步骤(2)和步骤(3)中，培养基的配制需单独灭菌再无菌混合才能凝固。本专利技术的积极效果如下：本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株具有良好的重金属抗性镉耐受浓度达1800mg/l，并且本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株的分离筛选方法对仪器要求低，操作简单，安全快捷。本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株对矿区受污染土壤修复具有重要的意义，具有重大的社会和经济价值。具体实施方式下面的实施例是对本专利技术的进一步详细描述。实施例11)试验材料⑴试验土样采自江西赣州崇义某钨矿矿集区经预先采样及检测的用于筛选的土壤经ICP检测Cd2+含量达5.07mg/kg。表层下0～20cm处。⑵马铃薯培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml、自然pH。⑶牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g、蛋白胨3g、NaCl1.5g、水300ml、pH7.0～7.5。2)耐镉菌株的分离、纯化、筛选及鉴定⑴耐镉菌株的分离与纯化：用无菌移液管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4各土样稀释液0.2mL于Cd2+浓度为10mg/L、30mg/L、60mg/L的3种浓度培养基的平板中，用无菌玻璃棒涂布均匀(每个浓度、每个梯度平行做3个)。室温(25℃左右)下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d。分离后长出的单菌落用接种环分别挑取少许置于Cd2+浓度60mg/L的同种培养基上，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d。待菌落长出后，检查其特征是否一致，同时将其进行镜检，是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯种培养。⑵Cd抗性菌株的高浓度筛选：将纯化所得菌株依次接种到含Cd2+浓度分别为60～1800mg/L的系列浓度梯度的同种培养基上，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d。挑选出抗高浓度Cd2+的优良菌株。在此过程中，用於筛选分离用途的高浓度培养基的配制需单独灭菌再无菌混合才能凝固。筛选所得的菌株最大耐受浓度Cd2+1800mg/l。⑶形态学初步鉴定及分子生物学鉴定：活化菌种12h，取活化的菌种稀释液10-1、10-2、10-3，接到新鲜培养基上，室温下培养3d后通过革兰氏染色法观察其生长形态。并取样进行16srRNA系列分析。3)菌株的鉴定结果本专利技术的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株是革兰氏染色阴性，短杆状，结合分子生物学16SrRNA系列分析可知该菌株为阴沟大肠杆菌Enterobacter sp属下的一个未命名种。4)菌株对模拟废水中镉的吸附效果研究将活化菌体以2％的接种量接种到新鲜的培养基中，pH7.0～7.5，30℃，中等转速摇瓶培养24h。10000r离心5min，收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株，其特征在于：所述的菌株的名称为肠杆菌Enterobacter sp，保藏编号为CGMCC NO.9795。

【技术特征摘要】
1.一种矿区土壤中超高浓度耐镉菌株，其特征在于：所述的菌株的
名称为肠杆菌Enterobacter sp，保藏编号为CGMCC NO.9795。
2.一种分离筛选如权利要求1所述的矿区土壤中超高浓度耐镉菌株
的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)土样采集：
采集矿区土壤表层下0～20cm处的土样，然后加水制得土样稀释
液；
(2)耐镉菌株的分离与纯化：
用无菌移液管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4各土样稀释液0.2mL
于Cd2+浓度为10mg/L、30mg/L、60mg/L的3种浓度培养基的平
板中，用无菌玻璃棒涂布均匀，每个浓度、每个梯度平行做3个，室
温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培养基上培养3d，分
离后长出的单菌落用接种环分别挑取少许置于Cd2+浓度60mg/L的
同种培养基上，室温下在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2d，马铃薯培
养基上培养3d，待菌落长出后，检查其特征是否一致，同时将其进
行镜检，是否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离、
纯化，直到获得纯种培养；
(3)Cd抗性菌株的高浓度筛选：
将纯化所得菌株依次...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明，聂锦霞，罗仙平，
申请(专利权)人：江西理工大学，
类型：发明
国别省市：江西;36