一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于激光外差干涉术的共聚焦显微成像系统，在现有激光共聚焦显微镜的显微镜光学系统、扫描部分的基础上，加入频移部分，结合光外差干涉技术实现精确测量。在充分利用了共聚焦扫描显微镜的超高横向分辨率的同时，又通过获取精确的相位信息取代强度信息，不仅提高了轴向分辨率，还避免了使用荧光染料带来的一系列问题；可以在无标记的情况下测量透明的相位物体。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法及系统
本专利技术涉及一种共聚焦扫描显微成像方法，属于光学精密测量领域，特别涉及一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，本专利技术还涉及利用上述方法的系统。
技术介绍
激光扫描共聚焦显微镜(Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是对普通光学显微镜的重大改进，主要由以下四个部分组成：显微镜光学系统；扫描装置，LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描；激光光源；检测系统。其基本思想由M.Minsky于1957年提出，与一般的显微成像不同，它在光路中加入了与物点共轭的探测针孔，起到了空间滤波作用，在使用荧光染料的情况下，能够去除离焦荧光的干扰，产生轴向层析能力，通过逐点逐层的扫描方式，实现对观测样品区域的光学层切，实现三维成像。它是一种无损伤的光学远场成像技术，能够同时提供较高的横向和轴向分辨率，这使得它有着极高的应用价值。共聚焦扫描显微镜与传统照明显微镜相比有许多优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线噪声干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，既显微CT。最近共聚焦显微镜在科研领域尤其是生物医学方面迅速发展，主要原因是其可以在不改变普通荧光显微镜的制片方法的前提下,可以观察到非常清晰的高质量图像,并且通过共聚焦显微镜可以十分方便的观察活的细胞或组织。由于共聚焦显微镜的突出优势,它已经成为生物医学研究中最重要的形态学研究工具之一。目前世界各大光学显微镜公司都在研发和生产共聚焦显微镜，主要体现在市面上常见的德国徕卡、蔡司、和日本尼康、奥林巴斯这几个品牌的产品中。由于共聚焦显微镜在观测时必要使用的荧光染料分子所带来的一系列问题，在激光的照射下，使用的许多荧光染料会产生单态氧或自由基等细胞毒素，必须限制扫描时间、激发光强度，以保持样品的活性，使得强度的对比度不高。同时，为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度；而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色，即光漂白效应。另外，激光共聚焦荧光扫描显微技术得到图像的对比度来自于激光激发样本产生的荧光强度，因此，如果不使用荧光染料，不能单独实现对透明样品进行非荧光标记的结构成像。对于这些透明样品，也就是相位样品，采用相位测量的方法可以得到高精度的结果，同时，不需要荧光染料标记，避免了染料带来的毒性及其他问题，并且相位信息的对比度比强度的对比度更高。现有技术中，可以与激光共聚焦荧光扫描显微技术结合的显微相位成像方法主要有以下几种：(1)激光斜射照明显微成像方法。在共聚焦显微系统的基础上，利用入射激光光轴和探测光轴所成的角度获得斜入射的照明光，从而获得浮雕效果。(2)微分干涉相差显微成像方法。利用两块沃拉斯顿棱镜(WollastonPrism)，起偏器(Polarzer)和检偏器(Analyzer)完成成像，成像结果可以呈现样品的浮雕状结构。上述的两种相位方法避免了使用荧光染料，但是，激光斜射照明显微成像方法由于需要调节探测光路和入射光路的角度，难以实现在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量，会导致需要大幅度修改原有显微镜结构才可以使用这种技术。微分干涉相差显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪切角进行位相差分探测，其所采用沃拉斯顿棱镜价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品进行探测，限制了使用范围。同时，这两种方法均不能获得精确到千分之一弧度的定量相位信息。另外，上述各处理方法中共聚焦显微镜的聚焦点均存在微米量级的光腰，在这个范围内，共聚焦显微镜是无法分辨的。激光外差干涉法是一种成熟的被广泛用于高精度测量领域的方法。在光外差探测中，带有被探测目标信息的信号光波与一个本振光波进行混频，经过混频后的光信号被光电探测所响应，并转化为电信号输出。混频信号一般包括本振光的频率分量、原始信号光的频率分量以及信号光和本振光的和频分量及差频分量，前三个信号由于频率太高不能被探测得到，所以经过光电探测器转换输出的只是信号光和本振光频率的差频分量。光外差法的精度可以达到千分之一个探测波长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，在共聚焦扫描显微镜的基础上，结合光外差干涉术，能够获得无荧光标记样品的高对比度的相位信息图像。本专利技术的另一个目的在于提供一种利用上述方法的共聚焦扫描显微成像系统，能够获得无荧光标记样品的高对比度的相位信息图像。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，包括：(1)将激光光源发出的单波长激光分成两束光，其中一束进入一个具有固定频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为信号光；另一束进入一个具有可调频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为本振光；所述可调频率为所述固定频率前后0.1-2MHz范围；(2)将所述信号光再次分成第一、第二信号光束，所述本振光再次分成第一、第二本振光束，其中将第二信号光束和第二本振光束进行合束并输入到第二光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出参考中频信号；(3)将第一信号光束进入共聚焦扫描系统，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返回并与第一本振光束进行合束并输入到第一光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出待测中频信号；(4)将采集到的参考中频信号和待测中频信号进行处理，得出聚焦点的相位信息；共聚焦扫描系统中的扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并合成样品的三维信息图像。对本专利技术方法的进一步改进，当在步骤(4)得到的某一聚焦点的相位信息时，聚焦点在物体平面内不动，扫描部分做轴向的微位移，得到聚焦点的相位发生连续变化，即相位随着时间变化，由于相位是包裹在(-π,π]中的，利用当前所得到的相位信息与前一时刻得到的相位信息比较，若时间前后的相位信息之差的符号发生变化时,就计数器加一；如此一来，当相位递增到波长/2的整数倍时，就实现整数计数，实现了聚焦点光腰内的相对测量。本专利技术方法采用偏振分束器来进行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半波片调制偏振方向。本专利技术方法步骤3中第一信号光束与共聚焦扫描系统之间经半波片、偏振分束器和四分之一波片调制耦合，半波片、偏振分束器使第一信号光束全部进入共聚焦扫描系统中，同时四分之一波片和偏振分束器使照射到样品部分后，按原路返回的第一信号光束由偏振分束器全反射输出。本专利技术方法步骤2、3中的合束光输入到光电探测器前，先进入检偏器，使得信号光和本振光的偏振方向保持一致，从而提高了拍频效率。为了可以避免空气的干扰，本专利技术采用光纤进行光束传输，这样参考光路中的信号光和本振光收到的干扰就变成一样，那么采集到参考中频信号基本是理想的参考中频信号，这样最终和待测中频信号进行对比时才能够得到最精确的相位信息。本专利技术的另一个目的，可通过以下技术方案实现：一种基于激光外差干涉术的共聚焦显微成像系统，包括激光光源部分，频移部分，共聚焦扫描部分，光信号采集部分及信号分析部分；激光光源包含输出一个单波长激光的激光器和将该激光分成两束激光的光源分束器；频移部分包含本振光传输光路和信号光传输光路；所述本振光传输光路设有可调频率的第一声光频移器、本振光分束器；信号光传输光路设有固定频率的第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，包括：(1)将激光光源发出的单波长激光分成两束光，其中一束进入一个具有固定频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为信号光；另一束进入一个具有可调频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为本振光；所述可调频率为所述固定频率前后0.1‑2MHz范围；(2)将所述信号光再次分成第一、第二信号光束，所述本振光再次分成第一、第二本振光束，其中将第二信号光束和第二本振光束进行合束并输入到第二光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出参考中频信号；(3)将第一信号光束进入共聚焦扫描系统，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返回并与第一本振光束进行合束并输入到第一光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出待测中频信号；(4)将采集到的参考中频信号和待测中频信号进行处理，最后得出聚焦点的相位信息；共聚焦扫描系统中的扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并合成样品的三维信息图像。

【技术特征摘要】
1.一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法，包括：(1)将激光光源发出的单波长激光分成两束光，其中一束进入一个具有固定频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为信号光；另一束进入一个具有可调频率的声光频移器调制，其输出的一级光作为本振光；所述可调频率为所述固定频率前后0.1-2MHz范围；(2)将所述信号光再次分成第一、第二信号光束，所述本振光再次分成第一、第二本振光束，其中将第二信号光束和第二本振光束进行合束并输入到第二光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出参考中频信号；(3)将第一信号光束进入共聚焦扫描系统，第一信号光束照射到样品部分后，按原路返回并与第一本振光束进行合束并输入到第一光电探测器上，经光电探测器对合束光采集后输出待测中频信号；(4)将采集到的参考中频信号和待测中频信号进行处理，最后得出聚焦点的相位信息；共聚焦扫描系统中的扫描部分进行逐点逐层扫描，得到一个个不同位置点的相位信息，并合成样品的三维信息图像。2.根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于当在步骤(4)得到的某一聚焦点的相位信息时，聚焦点在物体平面内不动，扫描部分做轴向的微位移，得到聚焦点的相位发生连续变化信息，利用当前所得到的相位信息与前一时刻得到的相位信息比较，若时间前后的相位信息之差的符号发生变化时,就计数器加一；当相位递增到波长/2的整数倍时，就实现整数计数，既实现对聚焦点光腰内的相对测量。3.根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于采用偏振分束器来进行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半波片调制偏振方向。4.根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于步骤3中第一信号光束与共聚焦扫描系统之间经半波片、偏振分束器和四分之一波片调制耦合，半波片、偏振分束器使第一信号光束全部进入共聚焦扫描系统中，同时四分之一波片和偏振分束器使照射到样品部分后，按原路返回的第一信号光束由偏振分束器全反射输出。5.根据权利要求1所述的共聚焦扫描显微成像方法，其特征在于步骤2、3中的合束光输入到光电探测器前，先进入检偏器，使得信号光和本...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翰林，刘满林，刘俊，安昕，张浠，
申请(专利权)人：佛山市南海区欧谱曼迪科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44