双特异性抗体制造技术

本发明专利技术提供的双特异性抗体是由一个完整抗体融合单链可变区片段（scFv）组成的，这两部分具有不同的抗原或抗原决定簇的特异性，完整抗体部分含有抗体恒定区或其修饰产物。在特定的实施方式中，完整抗体部分靶向表皮生长因子受体EGFR，单链可变区片段抗体部分靶向血管内皮生长因子VEGF。

【技术实现步骤摘要】
双特异性抗体
本专利技术涉及双特异性抗体，还涉及所述双特异性抗体的免疫偶联体、制备方法和 含有所述偶联体的药物组合物及其用途。 技术背景 双特异性抗体（BsAb)或双特异性单克隆抗体（BsMAb)是由两种不同的抗体片段 构成的一种人工蛋白质。由于包含两种不同的抗原结合域，一个双特异性抗体能够识别和 结合两个不同的抗原或两个不同的抗原表位。在肿瘤免疫治疗中，双特异性抗体能够同时 结合肿瘤细胞表面受体和细胞毒性细胞表面的受体，如CD3,将细胞毒性细胞靶向到肿瘤细 胞，进而杀伤肿瘤细胞。 双特异性抗体在各方面都面临着挑战。首先，他们难以工业化生产。更重要的是， 这类人工蛋白质在体外和体内的稳定性通常不高。当一个蛋白质中具有两个空间上非常接 近的抗原结合域，这两个抗原结合域能否保留彼此的结合活性是最需要关注的一个问题。 为了克服工业化生产困难，第一代双特异性单克隆抗体，也被叫做三功能性抗体， 已经开发出来了。它是由两条重链和两条轻链组成，每条重链和轻链都来自于两个不同的 抗体。两个Fab区域靶向两个抗原。Fc区域则是由这两条重链共同组成，形成第三个结合 位点，因此得名三功能性抗体。 其他类型的双特异性抗体也已被设计出来用于解决某些特定问题，例如半衰期 短、免疫原性和细胞因子释放引起的副作用。这些方法包括只有Fab区域的化学偶联Fabs， 以及各种类型的二价和三价的单链式可变区片段（scFvs)，模拟两个抗体可变区结构域的 融合蛋白。 在过去的一段时间内，其他类型的重组抗体形式也一直在发展，例如通 过融合一个IgG抗体和单链结构域而形成的四价双特异性抗体(参见Coloma,M. J.等，NatureBiotechl5 (1997) 159-163;W02001/077342 和Morrison,S.L·，Nature Biotech25(2007)1233-1234)。 同时其他几种新的形式也被开发出来，其中抗体核心结构（IgA、IgD、IgE、 IgG或IgM)不再保留，如二价、三价或四价抗体，小分子抗体，单链形式抗体（scFv， Bis-scFv)，它们都能够绑定两个或更多的抗原（Holliger,Ρ·等，NatureBiote ch23 (2005) 1126-1136;Fischer,N.,Leger,0.,Pathobiology74 (2007) 3-14;Shen ，J.等，JournalofImmunologicalMethods318(2007)65_74;Wu，C·等，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。 所有这些形式都是使用连接子来融合抗体核心部分（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和 另一个结合蛋白（如scFv)，例如融合两个Fab片段，或者scFvs(Fischer,N.，Leger, 0.，Pat hobiology74 (2007) 3-14)。其中通过维持与天然抗体的高相似性来保留抗体效应功能是非 常重要的，比如补体依赖细胞毒性（⑶C)或抗体依赖细胞的细胞毒性（ADCC)，这些都是通 过Fc受体结合介导的。 专利W02007/024715报道了双可变结构域免疫球蛋白，该蛋白为多价和多特异性 结合蛋白。美国专利6897044报道用于制备具有生物活性的抗体二聚体的方法。美国专利 7129330报道至少具有四个通过肽连接子连接的可变结构域的多价F.sub.V抗体。在专利 US2005/0079170中报告二聚体和多聚体的抗原结合结构。美国专利6511663报道了三或四 价单特异性抗原结合蛋白，其包括3个或4个通过共价键连接的Fab片段，该蛋白不是天然 的免疫球蛋白。专利W02006/020258报道了可以在原核和真核细胞中高效表达的四价双特 异性抗体，用于治疗和诊断。专利US2005/0163782报道了从两种类型的多肽二聚体的混合 物中分离或选择性地合成至少由一个链间二硫键连接的二聚体和不是至少由一个链间二 硫键连接二聚体的方法。美国专利5959083报告了四价双特异性受体。专利W02001/077342 中报道了具有三个或更多抗原结合位点官能团的工程抗体。 专利W01997/001580报道了具有多特异性和多价抗原结合的多肽。专利W01992/004053报道了一种同合物，通过合成交联共价连接具有相同的抗原决定簇的IgG 类单克隆抗体制备而成。专利W01991/06305报道了具有高抗原亲和力的IgG类低聚化单克 隆抗体，分泌表达两个或两个以上的免疫球蛋白单体，这些单体交联在一起以形成四价或 六价的IgG分子。美国专利6350860报道了羊源抗体和工程抗体的构建，可以用于治疗干 扰素Y活性相关疾病。专利US2005/0100543报道了双特异性抗体多价靶向载体的构建， 即靶向构建的每个分子可以作为两个或更多的双特异性抗体的载体。专利W01995/009917 报道了基因工程四价双特异性抗体。专利W0109254/2007报道了一种稳定结合分子，该分 子具有一个稳定的scFv。 表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor;EGFR)是一种由 1186 个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白。在多种人实体瘤中EGFR基因都存在着过度扩增和表达。 多年来的研究结果显示，EGFR的这种过度表达与肿瘤的形成、发生和发展有着密切的关系。 因此，表皮生长因子受体（EGFR)已成为近二十年来最热门的抗肿瘤药物开发靶点之一。 针对EGFR靶点有两类药物被开发。一类是针对EGFR胞外区的单克隆抗体，这一 类药物以已经上市的产品：爱必妥、帕尼单抗、尼妥珠单抗为代表；一类是针对胞内酪氨酸 激酶活性区的小分子激酶抑制剂，这一类药物以已经上市的产品：易瑞沙（Iressa)、吉非 替尼（erlotinib)为代表。这两类药物在临床应用中取得不错的效果，但也存在一个共同 的缺点：部分患者易产生耐药性或者说EGFR表达阳性的患者只有一部分受益，并且效果有 限。产生这种耐药性的原因是部分患者体内的KRAS基因发生突变，这样，虽然抗体或小分 子抑制剂阻止了EGFR胞内酪氨酸激酶的激活，但突变的KRAS蛋白使GTPase-直处于活性 状态，持续激活MAPK信号，产生了不依赖EGFR激活的MPK信号通路。 多种疾病的发病机制都与血管生成有关，包括实体瘤、眼内新生血管综 合征，如增殖性视网膜病或年龄相关性黄斑变性（AMD)，类风湿关节炎和牛皮癣等 (Folkman，J.等，J.Biol.Chem. 267 (1992) 10931-10934;Klagsbrun，M.等，AnnuRev. Physiol. 53 (1991) 217-239)。血管生成能够使肿瘤细胞比正常细胞获得更大的生长 优势，实现自主增殖。人血管内皮生长因子（VEGF/VEGF-A)负责调控正常的和非正 常的血管生成以及与肿瘤和眼内疾病相关的新生血管生成（Ferrara,N.等，Endocr. Rev. 18(1997)4-25;Berkman，R.A.等，J.Clin.Invest. 91 (1993) 153-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性抗体，其包含：（a）第一和第二条多肽，每一条多肽都包括一个免疫球蛋白轻链；以及（b）第三和第四条多肽，每一条多肽从N末端到C‑末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域（scFv），其特征在于每个所述第一和第二条多肽，与第三和第四条多肽的一个重链可变区形成特异性地识别EGFR的抗原结合位点；每一个scFv能够特异性地识别VEGF。

【技术特征摘要】
1. 一种双特异性抗体，其包含： (a)第一和第二条多肽，每一条多肽都包括一个免疫球蛋白轻链；以及（b)第三和第 四条多肽，每一条多肽从N末端到C-末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域 (scFv), 其特征在于每个所述第一和第二条多肽，与第三和第四条多肽的一个重链可变区形成 特异性地识别EGFR的抗原结合位点；每一个scFv能够特异性地识别VEGF。2. 根据权利要求1的抗体，第一和第二条多肽具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列或者与SEQ ID NO: 1具有至少90%相似性。3. 根据权利要求1或2的抗体，第三和第四条多肽具有SEQ ID N0:2氨基酸序列或者 与SEQ ID NO: 2具有至少90%相似性。4. 一种双特异性抗体，由两条轻链和两条长链组成，其中轻链的氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 1，长链氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 2。5. -种双特异性抗体，该抗体包含由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，其中重链 的恒定区与一个单链可变结构域（scFv)融合形成一条长链，这里完整的抗体具有EGFR特 异性，而一个单链可变结构域scFv具有VEGF特异性。6. 权利要求1-5中任一项的抗体，该抗体与类美登素化合物偶联，具有式la、Ib或Ic 结构，或其药学上可接受的盐或溶剂合物， 其中 X为氢或卤素； Y选自氢J1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(=0) R5 ; R1 选自 H、OH、OC (=0) R5 和 OR5 基团； R2为H或C1-C6烷基； R3 为甲基、-CH2OH 或-CH2OC (=0) R6 ; R4 为-OH 或-SH ; R5为C1-C6烷基或苄基； R6为C1-C6烷基、苯基或苄基； R7为氢或氨基酸侧链； R8为氢或者CV6烷基； n 为 0、1、2、3、4、5、6、7 或者 8。 P 为 3、4、5、6、7、8、9 或者 10 ; BsAb为双特异性抗体。7. 根据权利要求6所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓云，李胜峰，徐臣超，
申请(专利权)人：百奥泰生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44