单链抗体及其他异多聚体制造技术

本发明专利技术提供用1个、2个或3个系链构建的改造的异多聚体蛋白复合物，以及制备、使用、纯化此类复合物，例如具有不同结合性质的抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单链抗体及其他异多聚体本申请涉及并要求2012年2月10日提交的美国临时申请序号61/597,486的优先权益，其公开内容以引文整体并入本文。序列表本申请包含通过EFS-Web提交的ASCII格式的序列表，在此以引文整体并入此文。所述ASCII副本创建于2013年1月28日，命名为P4733R1WO_PCTSequenceListing.txt，大小为7501字节。专利
本专利技术涉及新的经改造的蛋白质和蛋白质复合物，包括具有单或多特异性的异多聚体(例如单链抗体、多链抗体和免疫粘附素-抗体复合物)、其构建和生产方法。本专利技术也涉及用于获得单或多特异性异多聚体的技术的新应用。本文提供的方法产生的异多聚体可用作任何疾病或病理状态的治疗剂，以及其中使用抗体是有利的的任何其他用途。专利技术背景开发用于生产可用于商业和治疗目的并可扩展，具有不同的结合特征(例如单特异性或多特异性)的抗体或其他异多聚体的技术一直很困难。已经尝试了许多方法，但几乎所有方法都存在显著的缺点，例如在哺乳动物细胞中难以溶解或不能表达、表现出异二聚体形成的产量低、技术上难以制造或有免疫原性、在体内显示短半寿期、或不稳定等等(例如Hollinger等人,(1993)PNAS90:6444-6448；US5,932,448；US6,833,441；US5,591,828；US7,129,330；US7,507,796；Fischer等人,(2007)Pathobiology74:3-14；Booy(2006)Arch.Immunol.Ther.Exp.54:85-101；Cao等人,(2003)55:171-197和Marvin等人,(2006)CurrentOpinioninDrugDiscovery&Development9(2):184-193)。因此，存在对生产具有不同结合特征的抗体或其他异多聚体的改进的技术和工艺的需求。专利技术概述本专利技术提供异多聚体(例如新单链抗体(scAb)、多链抗体(mcAb)和免疫粘附素-抗体复合物)以及创造、生产和使用该异多聚体的方法。一方面，本专利技术的特征为异多聚体单链抗体，包含连接第一重链可变(VH)结构域和第二VH结构域的异二聚化(HD)系链(tether)，其中异多聚体包含选自第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定(CH)结构域。在一个实施方式中，异多聚体包含至少一对重链恒定结构域。在另一个实施方式中，异多聚体可包含位于一条或两条重链上的VH和CH2结构域之间的铰链结构域。在另一实施方式中，异多聚体包含第一和/或第二CH1结构域。所述一个或两个CH1结构域位于一个或两个VH结构域的C端和一个或两个铰链结构域的N端，或者在不存在铰链结构域的情况下，一个或两个CH2结构域的N端。在特别实施方式中，异多聚体也可包含一个或两个轻链可变(VL)结构域，由一个或两个CLH系链(同族LC-HC系链)连接到第一和/或第二VH结构域的N端。在一些实施方式中，异多聚体还包含一个或两个轻链恒定(CL)结构域，各位于一个或两个VL结构域的C端，并紧邻一个或两个CLH系链的N端。另一方面，本专利技术的特征为异多聚体单链抗体，其包含单个多肽，如下具有在N端到C端方向相对彼此放置的以下结构域：VL1-CL1-CLH系链1-VH1-CH11-铰链1-CH21-CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链2-VH2-CH12-铰链2-CH22-CH32。另一方面，本专利技术的特征为多链抗体异多聚体，其包含3条多肽链，其中第一和第二多肽链相同，各形成轻链(LC)，并且第三条多肽链形成第一重链(HC)和第二HC。第一和第二多肽链各包含VL和CL结构域。第三多肽链包含两个VH结构域、HD系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。另一方面，本专利技术的特征为多链抗体异多聚体，其包含两个多肽链，其中第一多肽链形成第一轻链(LC)，第二多肽链形成第一重链(HC)、第二LC和第二HC。第一多肽链包含第一VL和CL结构域。第二多肽链包含两个VH结构域、HD系链、第二VL结构域、第二CL结构域、CLH系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。另一方面，本专利技术的特征为多链抗体异多聚体，其包含两个多肽链，其中第一多肽链形成第一LC、第一HC和第二HC，第二多肽链形成第二LC。第一多肽链包含两个VH结构域、HD系链、第一VL结构域、第一CL结构域、CLH系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域，和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VL1-CL1-CLH系链-VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。第二多肽链包含第二VL和CL结构域。另一方面，本专利技术的特征为异多聚体，其包含两条多肽链，其中第一多肽链包含免疫粘附素，所述免疫粘附素包含粘附素和一个或多个重链恒定结构域(例如CH21和/或CH31)，第二多肽链形成包含VH结构域和一个或多个重链恒定结构域(例如CH1、CH22和/或CH32)的半抗体，并且第一和第二多肽链由HD系链彼此相连，以形成单个多肽链。异多聚体的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：粘附素-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH-任选的CH1-任选的CH22-任选的CH32。HD系链促进免疫粘附素和半抗体的一个或多个恒定结构域之间的相互作用。在一个实施方式中，CLH系链促进半抗体的轻链和重链组分之间的相互作用，以获得具有在从N端到C端方向如下相对彼此放置的组分的异多聚体：粘附素-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH-CL-CLH系链-VH-任选的CH1-任选的CH22-任选的CH32。在另一个实施方式中，半抗体轻链的VL和CL结构域由第二多肽提供，所述第二多肽与第一多肽链的半抗体的重链缔合，以形成轻链-重链同族对。在另一个实施方式中，异多聚体的免疫粘附素部分可包含在其粘附素和重链恒定结构域组分之间的氨基酸间隔子。在一个实施方式中，间隔子包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基，例如GGS重复。在另一个实施方式中，间隔子长为10-80个氨基酸之本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含单条多肽的单链抗体，所述多肽包含以下组分：(a)第一VH(VH1)结构域和第二VH(VH2)结构域，(b)HD系链；和(c)一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH2(CH22)结构域，和第二CH3(CH32)结构域；并且其中所述组分在N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1‑任选的CH21‑任选的CH31‑HD系链‑VH2‑任选的CH22‑任选的CH32。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.10 US 61/597,4861.包含单条多肽的单链抗体，所述多肽包含在N端到C端方向相对彼此放置的以下结构域:VL1-CL1-CLH系链1-VH1-CH11-铰链1-CH21-CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链2-VH2-CH12-铰链2-CH22-CH32，其中所述单链抗体是双特异性或多特异性单链抗体，其中所述HD系链长30-39个氨基酸，且包含单字母缩写为G的甘氨酸和单字母缩写为S的丝氨酸残基，以及可被内肽酶切割的氨基酸序列；所述CLH系链1和所述CLH系链2各自长20-40个氨基酸，且包含G和S残基，以及可被内肽酶切割的氨基酸序列。2.权利要求1的单链抗体，其中所述HD系链包含GGS重复，所述CLH系链1和所述CLH系链2包含GGS重复。3.权利要求2的单链抗体，其中所述HD系链包含8至9个GGS重复。4.权利要求3的单链抗体，其中所述HD系链包含SEQIDNO:19所示的氨基酸序列。5.权利要求1的单链抗体，其中所述氨基酸序列被所述内肽酶在原位切割。6.权利要求5的单链抗体，其中所述氨基酸序列在纯化后在加入所述内肽酶后被切割。7.权利要求5的单链抗体，其中所述HD系链包含2个可被内肽酶切割的氨基酸序列，所述氨基酸序列位于所述HD系链的N和C端。8.权利要求1的单链抗体，其中所述内肽酶选自由弗林蛋白酶、尿激酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、genenase、Lys-C、Arg-C、Asp-N、Glu-C、因子Xa、烟草蚀纹病毒蛋白酶、肠激酶、人鼻病毒C3蛋白酶，和激肽原酶组成的组。9.权利要求8的单链抗体，其中所述内肽酶是弗林蛋白酶。10.权利要求9的单链抗体，其中所述HD系链包含2个内肽酶切割位点，所述切割位点位于所述HD系链的N和C端，其中所述内肽酶切割位点之一是弗林蛋白酶切割位点。11.权利要求9的单链抗体，其中可被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列RKRKRR。12.权利要求9的单链抗体，其中可被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列RHRQPR。13.权利要求10的单链抗体，其中所述内肽酶切割位点之一是Lys-C切割位点。14.权利要求1的单链抗体，其中所述内肽酶是弗林蛋白酶。15.权利要求14的单链抗体，其中所述CLH系链1或所述CLH系链2包含2个内肽酶切割位点，所述切割位点位于所述CLH系链1或所述CLH系链2的N和C端，其中所述内肽酶切割位点都是弗林蛋白酶切割位点。16.权利要求15的单链抗体，其中所述CLH系链1和所述CLH系链2各自包含2个内肽酶切割位点，所述切割位点位于所述CLH系链1和所述CLH系链2的N和C端，并且其中所述内肽酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。17.权利要求14的单链抗体，其中可被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列RKRKRR。18.权利要求14的单链抗体，其中可被弗林蛋白酶切割的氨基酸序列包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列RHRQPR。19.权利要求1的单链抗体，其中所述第一铰链结构域或所述第二铰链结构域包含人IgG1的Glu216至Pro230。20.权利要求19的单链抗体，其中所述第一铰链结构域或所述第二铰链结构域包含Lys-C内肽酶切割位点。21.权利要求20的单链抗体，其中所述Lys-C内肽酶切割位点包含失活突变。22.权利要求21的单链抗体，其中所述失活突变是EU编号系统的K222A替换。23.权利要求1的单链抗体，其中所述单链抗体能够结合至少2个抗原。24.权利要求1的单链抗体，其中所述单链抗体能够结合相同抗原上的至少2个表位。25.权利要求1的单链抗体，其中所述单链抗体在至少1个Fc组分上包含与功能部分缀合的恒定区。26.权利要求1的单链抗体，其中所述单链抗体在切割所述HD或CLH系链中的一个或多个后，包含外肽酶的一个或多个切割位点。27.权利要求26的单链抗体，其中所述一个或多个切割位点被所述外肽酶在原位切割，或者其中所述一个或多个切割位点在纯化后在加入所述外肽酶后被切割。28.权利要求26的单链抗体，其中所述外肽酶选自由羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N，和羧肽酶Z组成的组。29.权利要求28的单链抗体，其中所述羧肽酶B是血浆羧肽酶B。30.权利要求28的单链抗体，其中所述外肽酶在碱性残基处切割。31.权利要求30的单链抗体，其中所述外肽酶是羧肽酶B。32.权利要求1的单链抗体，其中所述CH31和CH32结构域各自包含凸起或空穴，并且其中所述CH31结构域中的所述凸起或空穴可分别置于所述CH32结构域中的所述空穴或凸起中。33.权利要求32的单链抗体，其中所述CH31和CH32结构域在所述凸起和空穴之间的界面相遇。34.权利要求1的单链抗体，其中所述多肽还包含：(a)所述CH11结构域或所述CH12结构域或二者中的凸起或空穴，和(b)所述CL1结构域或所述CL2结构域或二者中的凸起或空穴；并且其中：(c)所述CH11结构域中的所述凸起或空穴可分别置于所述CL1结构域中的所述空穴或凸起中，(d)所述CH12结构域中的所述凸起或空穴可分别置于所述CL2结构域中的所述空穴或凸起中；或(e)(c)和(d)二者。35.权利要求34的单链抗体，其中所述CH11和CL1结构域、所述CH12和CL2结构域，或全部4个所述结构域在所述凸起和空穴之间的界面相遇。36.权利要求1的单链抗体，其中所述CH21或CH22结构域中的一个或多个包含影响抗体效应子功能的CH2结构域突变。37.权利要求36的单链抗体，其中影响抗体效应子功能的所述CH2结构域突变是N297突变。38.编码权利要求1-37中任一项的单链抗体的多核苷酸。39.包含权利要求38的多核苷酸的载体。40.包含权利要求39的载体的宿主细胞。41.权利要求40的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。42.权利要求41的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。43.权利要求40的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。44.权利要求43的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。45.生产权利要求1-37中任一项的单链抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含权利要求39的载体的宿主细胞。46.权利要求45的方法，其中所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述单链抗体。47.抗体，包含以下组分：(a)第一多肽，包含第一VL(VL1)结构域和第一CL(CL1)结构域；和(b)第二多肽，包含：(i)第一VH(VH1)和第二VH(VH2)结构域，(ii)HD系链，(iii)第二VL(VL2)和第二CL(CL2)结构域，(iv)CLH系链，(v)第一铰链(铰链1)结构域或第二铰链(铰链2)结构域或二者；和(vi)一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域，和第二CH3(CH32)结构域；并且其中所述第二多肽的所述组分在N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1-CH11-铰链1-CH21-CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链-VH2-CH12-铰链2-CH22-CH32，其中所述HD系链长30-39个氨基酸，且包含单字母缩写为G的甘氨酸和单字母缩写为S的丝氨酸残基，以及可被内肽酶切割的氨基酸序列；所述CLH系链长20-40个氨基酸，且包含G和S残基，以及可被内肽酶切割的氨基酸序列。48.权利要求47的抗体，其中所述一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一重链恒定结构域配对。49.权利要求47的抗体，其中所述HD系链包含GGS重复。50.权利要求49的抗体，其中所述HD系链包含8至9个G...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·弗拉尼克，D·L·伊顿，E·H·克里斯腾森，J·吴，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH