本发明专利技术公开了一对蒙古人种及高加索人种低免疫原性的，抗EGFR的人鼠嵌合抗体，还公开了该抗体的制备方法以及利用该抗体制备抗肿瘤药物的应用。在该发明专利技术中，我们主要针对临床安全性进行如下的优化：1）西妥昔单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白G1m3同种异型氨基酸，这种选择使得西妥昔单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生治疗性抵制。因此在该发明专利技术中突变其恒定区部分氨基酸使其适于蒙古人种及高加索人种；2）将NS0表达系统更换为CHO表达系统，降低或消除其Di-α1,3GalGal修饰的组分，使本发明专利技术单抗具有更低的免疫原性。
【技术实现步骤摘要】
对蒙古人种和高加索人种低免疫原性的、抗EGFR的人鼠嵌 合抗体
本专利技术属于基因工程领域，涉及一个与EGFR特异性结合，但对蒙古人种及高加索 人种适用的、低免疫原性的人鼠嵌合抗体分子实体及其应用。 本专利技术主要涉及通过基因工程手段将已经上市的西妥昔单抗（Cetuximab， Erbitux)进行基因工程改造，突变其恒定区对蒙古人种产生高免疫原性的氨基酸，使得改 造后的人鼠嵌合性抗体更适用于蒙古人种、高加索人种的基因表型。本专利技术还涵盖了该抗 体在治疗肿瘤，尤其是EGFR高表达的头颈癌、结直肠癌和胃癌中的应用。
技术介绍
研究发现，表皮生长因子受体（EGFR)信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、 侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。更进一步研究发现，EGFR高表达的头颈癌患者及 转移性结直肠癌患者对EGFR抑制剂治疗反应敏感。这种良好的敏感性在EGFR基因未突变 但KRAS基因突变的上述患者中更为显著。 西妥昔单抗（中文商品名：爱必妥，英文商品名：Erbitux)由英克隆公司（目前是 礼来的全资子公司）研发，并于2004年在美国、欧洲上市，2006年中国上市。西妥昔单抗可 与表达于肿瘤细胞表面的EGFR特异性结合，通过3大机理杀死转移性结直肠癌细胞和头颈 癌细胞：（1)与内源性配体竞争结合EGFR，阻断肿瘤细胞增殖的信号通路；其亲和力高于内 源性配体如EGF及TGF-a;(2)Erbitux引发了 了抗体介导的EGFR受体二聚、内吞及降解， 下调了EGFR受体的表达，增强了肿瘤细胞对放化疗的敏感性；（3)Erbitux具有ADCC效应， 对肿瘤细胞进行杀伤（Mitchell,NatureBiotechnology, 2004,V22:363-364.)。自西妥昔 单抗上市以来，很快在临床上得到广泛应用并跨入重磅炸弹药物行列，其2012年全球销售 已达11. 5亿美元(彭博社消息，2013年6月1号消息)。 尽管西妥昔单抗的上市给EGFR高表达肿瘤患者带来巨大的福音，随着科学研 究的进展及临床观察及荟萃分析，西妥昔单抗在临床上也存在下述潜在问题：（1)西妥 昔单抗治疗效果在不同患者个体之间差异较大，即使针对EGFR未变异、KRAS基因变异 的高有效群体患者也是如此（Misaleetal. ,Nature, 2012,V486:532-536.);(2)患 者经西妥昔单抗治疗一段时间后，患者会发生获得性抵制（Montagutetal.，Nature Medicine, 2012,V18:221-223;)，从而影响了西妥昔单抗的治疗效果。这种获得性抵制 主要由在患者机体能随着西妥昔单抗给药次数的增加而产生了针对西妥昔单抗的抗体。 患者机体产生针对西妥昔单抗的抗体，会由下述3种原因引起：（1)西妥昔单抗是人鼠嵌 合性抗体，其中鼠源的区序列会引起机体的免疫反应；（2)西妥昔单抗由鼠杂交瘤NSO细 胞生产，产品中含有约30%Di_al，3GalGal修饰的组分，这种组分在人体内会引起比较 强的免疫原性（Jefferis.NatureReviewsDrugDiscovery，2009，V8:226-234·); (3) 由患者基因多态性引起的免疫原性〇€€61^8 6七31.，111^8,2009，￥1:1-7;?.?311(167· mAbs，2012,V4:553-554.)其中不同人种间基因多态性决定了西妥昔单抗的治疗性抵制与 不同患者个体间治疗效果的差异。 西妥昔单抗构建主要基于高加索人种免疫球蛋白Glm3同种异型氨基酸，这种选 择使得西妥昔单抗在用于蒙古人种的治疗时更容易因产生抗体而发生西妥昔单抗的治疗 性抵制。因此，针对一个很好靶点及已取得很好疗效的西妥昔单抗，在蒙古人种的治疗上仍 存在进一步改良的、迫切的需要，以在临床上发挥更佳的临床效果，用于头颈癌、结直肠癌 及胃癌的治疗。
技术实现思路
针对上述西妥昔单抗在临床应用中的限制，本专利技术通过突变西妥昔单抗重链恒定 区的氨基酸，获得更适于蒙古人种和高加索人种的、抗EGFR的单克隆抗体，其结构式见SEQ ID:1 (专利技术所述抗体的重链）与SEQID:2 (专利技术所述抗体使用与西妥昔单抗相同的轻链)。 含轻、重链基因的载体经真核细胞分泌表达，形成由16对2硫键连接的本专利技术所述的完整 抗体： 本专利技术的目的是进一步提升西妥昔单抗在临床上的普适性及安全性，提供一种更 适于蒙古人种和高加索人种的、抗EGFR的、提升其临床安全性的单克隆抗体。 本专利技术的另一个目的是提供上述单抗在制备肿瘤药物中的应用。 本专利技术是通过下列技术措施实现的： 一种抗EGFR的、人鼠嵌合的单克隆抗体，所述抗体： (i)所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免 疫球蛋白同种异型氨基酸； (ii)所述重链具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列； (iii)所述重链与西妥昔单抗（Cetuximab)轻链（SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列）结合成完整的单克隆抗体。 上述的抗体，其特征在于：突变西妥昔单抗重链恒定区的氨基酸，使西妥昔单抗 重链恒定区免疫球蛋白Glm3同种异型转为Glml7同种异型。 上述抗体，其特征在于：将西妥昔单抗重链中（SEQIDNO:3所示的氨基酸序列） DKRV序列突变为DKKV序列。 -种编码上述抗体的核苷酸序列。 一种包含上述抗体表达载体的宿主细胞。 上述的宿主细胞，其特征在于宿主细胞为真核细胞。 上述的宿主细胞，优选NSO细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。 上述的宿主细胞，优选CHO细胞系。 -种组合物，上述组合物包含权利要求1所述抗体。 上述的抗体在制备抗肿瘤药物的应用。 上述的抗肿瘤药物，优选头颈癌，结直肠癌和胃癌。 本专利技术中所用术语西妥昔单抗，由Lilly旗下的Imclone公司开发，其CAS号 为：205923-56-4。 本专利技术中所用术语免疫球蛋白同种异型（IgGallotype)是一种遗传标志，指同 一种属不同个体间的免疫球蛋白分子抗原性的不同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。 同种异型抗原性的差别往往只有一个或几个氨基酸残基的不同，可能是由于编码免疫球蛋 白的结构基因发生点突变所致，并被稳定地遗传下来，因此免疫球蛋白同种异型可作为一 种遗传标记（geneticmarkers),这种标记主要分布在抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区 上(http://www.wiki8.com/mianyiqiudanbai28442/)。 IgGl重链恒定区上的同种异型γ1、γ2、γ3重链上均存在有同种异型标记。目前 已发现：Glml、2、3、17 ;6211123;6311121、28、11、5、13、14、10、6、24、15、16、26、27，共20种左右。 其中Glm、G2m、G3m分别表示亚类IgGl,IgG2 和IgG3,m代表标记（Jefferisetal.，mAbs， 2009,Vl：1-7 ； )〇 西妥昔单抗为IgGl型单抗，因此其同种异型主要有Glml、2、3、17共计4种。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗EGFR的、人鼠嵌合的单克隆抗体，所述抗体： (i) 所述重链具有IgGγ1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球蛋白同种异型氨基酸； (ii) 所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列； (iii) 所述重链与西妥昔单抗（Cetuximab）轻链（SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列）结合成完整的单克隆抗体。
【技术特征摘要】
2013.07.29 CN 201310323700.X1. 一种抗EGFR的、人鼠嵌合的单克隆抗体，所述抗体： (i) 所述重链具有IgGY 1恒定区，该恒定区含有适合蒙古人种及高加索人种的免疫球 蛋白同种异型氨基酸； (ii) 所述重链具有SEQ ID NO :1所不的氣基酸序列； (iii) 所述重链与西妥昔单抗（Cetuximab)轻链（SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列）结 合成完整的单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：突变西妥昔单抗重链恒定区的氨基酸， 使西妥昔单抗重链恒定区免疫球蛋白Glm3同种异型转为Glml7同种异型。...
【专利技术属性】
技术研发人员：于鹏展，吴伟，
申请(专利权)人：西藏海思科药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏;54
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