针对疟原虫乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于疟疾诊断的用途制造技术

本发明专利技术提供了结合疟原虫蛋白乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于诊断疟疾的用途。针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于通常检测疟原虫物种的存在，而针对乳酸脱氢酶的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对疟原虫乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于疟疾诊断的用途交叉引用相关申请本申请要求2012年2月9日提交的美国临时申请序列号61/596,774的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及特异性结合疟原虫(Plasmodium)乳酸脱氢酶(LDH)和富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体及其用于诊断疟疾的用途。背景疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。尽管存在可以感染人的四种疟原虫，但物种恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)引起疟疾的最危险形式，具有最高的死亡率。根据世界卫生组织(WHO)，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例死亡。此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。根据世界银行，疟疾使非洲每年花费约120亿美元，且每年使国内生产总值(GDP)减缓超过1％。疟疾的负担使家庭和社区陷入由于生产力损失导致的更深的贫困和对国内和国外投资和旅游业的负面影响。此外，疟疾大大影响社会的结构，因为高死亡率经常折磨五岁龄以下的年龄组。美国疾病控制和预防中心注意到，虽然彻底消除疟原虫将是最优的，但这对于大部分疟疾流行的国家是不现实的。疟疾病例的改进管理对于控制疟疾传播是根本性的。快速诊断测试(RDT)对于管理疟疾以减少疟疾的发病率、死亡率和传播是至关重要的。对于疟疾常用的RTD包括显微镜测定法、聚合酶链式反应(PCR)测定法、和基于抗体的测定法。疟疾的显微镜诊断，其基于血液涂片中疟原虫的显微镜观察，可以区分不同种的疟原虫。基于PCR的检测也可以以高灵敏度区分不同种的疟原虫。然而，显微镜和基于PCR的诊断测试两者都需要昂贵的设备和训练有素的健康护理工作人员，这通常对于发展中国家中的大多数处于风险中的群体是不可得的。基于抗体的测定法利用抗体来检测疟原虫抗原。用于疟疾诊断的常用疟原虫抗原包括疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)、富含组氨酸蛋白2(PfHRP2)和醛缩酶。尽管基于抗体的快速诊断测定法已经使疟疾管理大大受益，但它们具有显著的缺点，包括热不稳定性、批次间变化和高生产成本。因此，对于用于疟疾诊断的改进方法存在需求。概述本专利技术提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶和疟原虫富含组氨酸蛋白II的核酸适体(本文中被称为“疟疾适体”)和使用这些疟疾适体诊断和治疗疟疾的方法。在一个实施方案中，本专利技术提供了以高特异性和亲和力靶向并结合两种疟疾蛋白乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体。针对乳酸脱氢酶的适体可用于泛物种检测(pan-speciesdetection)疟原虫，而针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。并行地，可以将这两种适体并入装置以通常检测疟原虫和诊断疟疾，以及确定疟疾是否特异性地由恶性疟原虫引起。本专利技术涉及使用疟疾适体作为用于诊断疟疾的诊断装置的组分的方法。该方法提供了基于疟疾适体与疟疾蛋白目标的结合的特异性的疟疾抗原的特异性检测。在某些实施方案中，本专利技术提供了包含本专利技术的核酸适体、或此类适体的稳定的衍生物、或其药学上可接受的盐的制剂。该制剂可以包含结合疟原虫乳酸脱氢酶或疟原虫富含组氨酸蛋白II或其变体或片段的任何适体。本专利技术还提供了使用本专利技术的核酸适体用于通过特异性结合疟原虫编码蛋白和/或抑制疟原虫编码蛋白的功能而诊断或治疗疟疾的方法。在诊断方面，本专利技术可以与其它诊断方法组合使用。在一个实施方案中，本专利技术可以给个体施用单独或与其它药物组合的一定量的疟疾适体。在一个实施方案中，本专利技术还提供了定量样品中疟原虫蛋白水平的诊断方法。疟疾适体可以通过可检测物质进行标记，所述可检测物质包括但不限于荧光材料、酶、发光材料和放射性材料。本专利技术的此类实施方案可以用于检测生物样品中的疟原虫蛋白水平。附图简述图1是描绘使用“通过指数富集配体的系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)”(SELEXTM)方法体外选择适体的示意图。图2显示体外选择LDH适体的琼脂糖凝胶分析。在第1、第3、第5、第7、第9、第12、第15、第18、第19和第20轮采集的样品。图3显示本专利技术的适体的实施方案的核酸序列。所述适体特异性结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)或富含组氨酸蛋白2(HRP2)。分别在20轮针对恶性疟原虫PfLDH或针对恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRP2)的SELEX(包括通过使用人LDH和磁珠的反向SELEX方法)之后从ssDNA库克隆并测序适体。图4是显示使用等温滴定量热法的2009(在每个5'和3'末端具有两个18聚体(18-mer)序列的PfLDH适体)和2009s之间的比较的图。左侧小图是2009的原始量热法数据和结合等温线，右侧小图是2009s(SEQIDNO:3)的原始量热法数据和结合等温线。通过连续注射用适体滴定PfLDH，且使用单一结合位点模型拟合结合等温线。图5是显示PfLDH适体(SEQIDNO:1;2004s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体剂(SEQIDNO:1;2004s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。图6是显示PfLDH适体(SEQIDNO:2;2008s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQIDNO:2;2008s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。图7是显示PfLDH适体(SEQIDNO:3;2009s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQIDNO:3;2009s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。图8是显示PfLDH适体(SEQIDNO:4;2021s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQIDNO:4;2021s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。图9显示四聚的PfLDH与两个本专利技术的DNA适体的结合。(A)四聚的LDH在与本专利技术的DNA适体的两个具体实施方案的复合体中的晶体结构。(B)复合状态中本专利技术的DNA适体的具体实施方案的结构，以及该DNA适体的核酸序列。(C)适体与PfLDH(左)和人LDHA1和LDHB(右)结合的等温滴定量热法滴定。图10显示在蛋白：适体结合：适体结合界面处的底物特异性环决定适体对于PfLDH相比于hLDH的辨别。(A)DNA适体与PfLDH的直接相互作用。(B)适体结合的辨别是由于底物特异性环中的差异。PfLDH和hLDHB的底物特异性环显示于(B)。图11显示用于分子诊断中的缀合至金纳米颗粒的适体。(A)方法的原理。(B)单独的纳米颗粒(左)、适体缀合的纳米颗粒(中)和在PfLDH存在的情况下适体缀合的纳米颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合疟原虫乳酸脱氢酶的适体，其包含与SEQ ID NOs:1‑4中任一种具有至少85％同一性的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.09 US 61/5967741.结合疟原虫乳酸脱氢酶的适体，其由选自SEQIDNOs:1-4中任一种的核酸序列组成。2.根据权利要求1的适体，其中所述适体与一个或多个选自脱氧胸苷核苷酸、反转胸苷和聚乙二醇的部分缀合。3.根据权利要求1的适体，其中所述适体是具有由脱氧核糖-磷酸酯键形成的骨架的寡核苷酸。4.根据权利要求1的适体，其中所述适体是这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包含由一个或多个硫酯键和/或一个或多个酰胺键稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸酯键。5.结合疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的适体，其由选自SEQIDNOs:5-11中任一种的核酸序列组成。6.根据权利要求5的适体，其中所述适体与一个或多个选自脱氧胸苷核苷酸、反转胸苷和聚乙二醇的部分缀合。7.根据权利要求5的适体，其中所述适体是具有由脱氧核糖-磷酸酯键形成的骨架的寡核苷酸。8.根据权利要求5的适体，其中所述适体是这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包含由一个或多个硫酯键和/或一个或多个酰胺键稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸酯键。9.试剂盒，其包含根据权利要求1的适体，和载体。10.试剂盒，其包含根据权利要求5的适体，和载体。11.核酸适体在制备用于诊断个体中的疟原虫感染的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐柱霖，张绮蕙，小高雅代，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：中国香港;81