香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，依次进行以下步骤：①待鉴定样品基因组DNA的提取；②以基因组DNA为扩增模板，用特异性引物和Taqman探针，进行实时荧光PCR检测；引物为：F-Primer:5’-CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3’，R-Primer:5’-AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3’，探针为：Probe：5’-(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。本发明专利技术能用于有效地从蛀果性害虫(包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等)中区分出香梨优斑螟。

【技术实现步骤摘要】
香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法与应用
本专利技术涉及一种香梨优斑螟污染的分子检测方法，具体地说，涉及一种香梨优斑 螟荧光PCR检测方法，其属于生物
。
技术介绍
香梨优斑螟（Euzophera pyriella Yang)属鳞翅目螟蛾科斑螟亚科优斑螟属的杂 食性害虫，是1994年经杨集昆教授定名的害虫新种，为新疆特有的果树蛀千害虫。自20世 纪8〇^年代后期首次发现以来，扩散蔓延，危害严重，其中库尔勒香梨被害株率最高，受害株 率常高达100%，是香梨的主要害虫之一。主要危害梨、苹果、无花果、枣、杏、巴旦杏、桃等果 木，严重影响果品产量和品质。 以幼虫危#果树和林木的枝、干，在寄主的靭皮部与木质部之间蛀食为害，形成不 规则的隧道，影响寄主的生长，严重时造成死枝。蛀孔外常堆集褐色颗粒状粪便，较易识别。 幼虫还危害果实，蛀食果肉，果心和种子，在新疆梨园、苹果园中与其他食心虫混合危害，使 虫果率上升。该虫危害可以引起梨树腐烂病发生，造成树势衰弱，甚至死亡。 香梨优斑螟形态特征，成虫：体长6?10mm，翅展14?20mm。体大部分呈灰褐色 至暗褐色被鳞光滑。复眼大而圆赤褐色。前翅狭长灰褐色，两条灰白色横线之间颜色较暗。 后翅灰褐，外缘较深，缘毛灰白。卵：椭圆形，长约0. 55?0· 60mm，宽0· 30?0. 55圓，表面 密布网纹，初产时乳白色，孵化前暗红色。幼虫：老熟幼虫体长8?17mm，体色深灰色（灰 黑色），头部棕褐色，腹足趾钩 2序，全环式。蛹：长约7mm，腹面黄褐色，背面褐色，臀刺12 或13个。 香梨优斑螟的发生特点：一年发生3代，以老熟幼虫在树干的翘皮、裂缝、树洞中 结灰白色长形薄茧越冬，也有的在为害蛀食处或苹果、梨的果实内越冬。翌年3月下旬开始 化蛹，4月上、中旬为化蛹盛期，4月下旬为羽化盛期。第1、2代成虫羽化高峰分别在 6月上 中旬和7月中下旬，第3代幼虫7越下旬和8月上旬发生。 10月份幼虫逐渐进入越冬状态。 幼虫蜕皮4次，共5龄，幼虫历期25?40天，主要为害香梨树枝杆和香梨果实。十几年前 只在新疆局部个别香梨园为害，现已遍布天山南北，成为香梨等果树的重要害虫之一。 苹果蠹蛾（Cydia pomonella L.)，梨小食心虫（Grapholitha molesta(Busck))和 香梨优斑螟为我国常见的蛀果性害虫，此三种害虫的低龄幼虫在外部形态上非常相似，没 有显著差异，目前,我国检疫部门对梨小食心虫的分类鉴定主要是以老熟幼虫或成虫的外 部形态特征为依据，在果品出口、运输和实施检疫控制前准确地区分检疫性害虫是相当必 要的，目前大多凭借形态学特征只能区分成虫、晚龄期害虫，大多数的检疫性有害生物较短 暂的幼虫阶段很难依靠形态学特征精确区分，但苹果蠹蛾、梨小食心虫和香梨优斑螟等有 舍·生物的幼虫基本是在水果采收时大量出现，同时中、外双方截获的害虫形态特点都不明 显，有时以残体形式出现，给种类的鉴定带来很大困难。国外在截获有害生物时，截获检疫 性有害生物和截获一般有害生物，对货物处理，产地的制裁，出口的限制有很大的区别。从 收到的国外通报看，对方国对截获有害生物的鉴定结果五花八门，我方想对对方结果进行 质疑，缺乏有力的证据和方法。检验方法的不成熟和低分辨率依然会造成进口国在截获检 疫性有害生物时采取严厉制裁措施的风险。带来过多的技术纠纷，增加禁止出口的风险，增 加检疫性处理或者退货会产生较大的费用消耗。因此，建立一种香梨优斑螟快速、灵敏、准 确的分子生物学检测方法是十分必要和紧迫的，对口岸检疫和防治监测都有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法。本专利技术 具体给出了用于香梨优斑螟实时荧光PCR检测的引物和Taqman探针，本专利技术能用于有效地 从蛀果性害虫（包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等）中区分出香梨优斑螟。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法， 检测中所用的特异性引物和探针的核苷酸分别为 ： 特异性引物为： F-Pr imer: 5 ' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3， R-Primer: 5，-MTAGGGTCTCCCCCTCCT-3， 探针为： Probe : 5 ' _ (FAM) CGGMTCTTMTACTTCTTTTTTTGACCCTG (TAMRA) -3 '。 B卩，本专利技术给出了一种香梨优斑螟的鉴定引物，其核酸序列如SEQ ID No. 1和2所 示，其中，SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列为正向引物，SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列为反 向引物。 YB-FP :5' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3'（SEQ ID No· 1)或其互补链； YB-RP :5' -AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3'（SEQ ID No. 2)或其互补链； 本专利技术用于香梨优斑螟实时荧光PCR检测的Taqman探针，该探针针对上述引物的 扩增区域内，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，即本专利技术所述的Taqman探针为：5'-(FAM) CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)_3'（SEQ ID No. 3)或其互补链。 本专利技术所述的引物和Taqman探针由Takara(大连，中国）公司委托合成及标记。 特别地，本专利技术利用通用引物对不同地区的31次采样的近500只香梨优斑螟、苹 果蠹蛾和梨小食心虫样本进行PCR扩增，产物纯化、克隆、测序后，分别得到527bp，504bp 和517bp的序列，各物种的C0I基因长片段用CLUSTAL 2. 1和DNA-star等软件进行比对 分析，筛选出差异位点较多的区段，进而在该区段使用Primer premier 5.0和ABI Primer ExpreSS3. 0软件设计特异性引物和荧光探针，并用BLAST程序验证引物特异性。该引物/ 探针组合具有较高的检测灵敏度和扩增特异性，能高效的将香梨优斑螟与其他相似的检验 检疫性害虫区分开。 本专利技术还提供了一种使用上述香梨优斑螟特异性引物和Taqman探针鉴定香梨优 斑螟的方法，包括以下步骤： ①待鉴定样品基因组DNA的提取； ②实时荧光定量PCR扩增体系设置： 以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针（Taqman探针），进行实时荧 光PCR检测； ③扩增结果分析及结果判断：根据实时荧光扩增曲线判定样品检测结果。 其中，步骤①提取样品基因组DNA的具体步骤为：将待鉴定样品放入研钵内，导 入液氮，充分研磨后，加入裂解液，待溶化后用移液器转移至1. 5mL离心管内，采用试剂盒 离心柱法提取基因组DNA，试剂盒共采用了北京全式金（EE111)、天根（DP304)、北京鼎国 (NEP001)、Qiagen (69504)等4种植物DNA提取试剂盒。DNA浓度及纯度通过ND-2000C核 酸蛋白分析伩检测。 所述的样品为香梨优斑螟成虫，老熟幼虫，小龄本文档来自技高网...

【技术保护点】
香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，其特征是：检测中所用的特异性引物和探针的核苷酸分别为：特异性引物为：F‑Primer:5’‑CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT‑3’R‑Primer:5’‑AATAGGGTCTCCCCCTCCT‑3’探针为：Probe：5’‑(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)‑3’。

【技术特征摘要】
1. 香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，其特征是： 检测中所用的特异性引物和探针的核苷酸分别为： 特异性引物为： F-Primer:5 ' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3 ' R-Primer:5 ' -AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3 ' 探针为： Probe :5' -(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3'。2. 根据权利要求1所述的香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，其特征是依次进行以下 步骤： ① 、待鉴定样品基因组DNA的提取； ② 、实时荧光定量PCR扩增体系设置： 以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测； ③ 、扩增结果分析及结果判断。3. 根据权利要求2所述的香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，其特征是： 探针的5'端标记有报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、 CY3或CY5,探针的3'端标记有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ 或ECLIPSE。4. 根据权利要求2或3所述的香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，其特征是： 所述步骤②实时荧光定量PCR扩增体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤军，冯俊丽，华鹏，张伟，张祥林，王鹏举，郭铁群，刘永杰，
申请(专利权)人：中华人民共和国库尔勒出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：新疆;65