用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其基因序列包括家蚕丝H链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及柞蚕、天蚕蚕丝H链基因；还公开了该种丝蛋白肽段的制备方法，具体包括家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达。该方法简单易行，序列准确无误，构建的表达载体没有发生基因突变或缺失，保证了表达产物不会发生三联码的错配或个别氨基酸错误，获得的产物用于进一步制备高精确度的蚕丝抗体。目前还没有来自于家蚕白色丝品种(丝素非结晶区及结晶区/非结晶区单元的)和柞蚕黄色丝或天蚕绿色丝品种的肽段制备的报导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于蚕品种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段 (抗原）及其制备方法。
技术介绍
蚕丝丝素（以下简称丝素）蛋白属于天然动物蛋白纤维，是一种结构蛋白，由结晶 态和无定形态两大部分组成。丝素蛋白包括家蚕丝和野蚕丝（柞蚕丝、天蚕丝等）。家蚕 丝素是重链（H链）蛋白、丝素轻链（L链）蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，柞蚕 丝、天蚕丝丝素由Η链组成。 家蚕丝素由于来源丰富，数十年来也是研究的热点，学者对其结构、性能及生物材 料应用方面进行了大量的研究，然而，有关野蚕丝素方面的研究国内外报道极少，如天蚕丝 素、柞蚕丝素等天然彩色丝素。天蚕丝、柞蚕丝是天然彩色蚕丝的代表，天然彩色丝是一种 绿色产品，对减少环境污染，促进人类健康非常有利。具有天然淡黄色的柞蚕丝在日本市场 及欧洲市场上极受欢迎。目前，国际市场的天然有色昆虫丝十分紧缺，以黄色野蚕丝为例， 价格是白色蚕丝的3-30倍。天然彩色黄茧或绿茧茧丝中含有的黄酮类化合物，来自于食用 的桑叶，因此不仅具有白色蚕丝良好的吸湿性、放湿性、保暖性和透气性丝，还具有良好的 抑菌功效和抗氧化的阻挡紫外线的功能，能有效地防止因环境污染引起人体内发生氧化作 用所造成的危害。除此，天蚕丝素、柞蚕丝素等天然彩色丝素蛋白肽链上含有一种特殊的序 列：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD)三肽序列，这种R⑶三肽序列广泛存在于胶原蛋白、 粘着蛋白等细胞外基质中，有助于细胞粘附，促使帖壁细胞粘附生长，可以作为医疗领域组 织修复选用的最佳材料之一。因此，选育彩色茧实用品种，并及时进行大规模生产开发，具 有非常诱人的商业前景，将大大推动新型蚕品种的开发力度和开拓蚕丝业发展的新局面。 但由于天蚕、柞蚕等天然彩色茧蚕品种难以饲养，蚕丝来源比较稀少，所以应用极 其稀少，而且目前我们研究的天然黄色家蚕丝的色素主要存在于丝胶中。 已经研究证实天蚕、柞蚕等天然彩色丝的色素来自于桑叶，而且摄入家蚕体内的 黄酮物质是否能够从消化管进入血液、从血液进入丝腺，受到消化管和丝腺上皮细胞的透 过性影响，即受到色素生成及运输的基因的控制。目前已有多种色茧基因已被鉴定，我们将 在分子育种时可以导入茧色相关基因，培育出具有稳定遗传的色素生成及运输控制基因的 蚕品种，使合成与分泌的蚕丝具有天然色素。另外色茧基因一经鉴定，可以通过分子生物学 技术克隆可能的相关基因进行遗传杂交品种的筛选，选育出理想的天然彩色茧蚕品种，制 备不含任何化学成分的来自于天然植物并在蚕体内经修饰过的天然彩色蚕丝一新世纪的 绿色纤维及其产品。 研究开发基于白色丝家蚕和柞蚕、天蚕等天然彩色丝等品种蚕的优良易饲养、稳 定遗传的天然彩色家蚕品种，品种育成后，我们必须对其产品（茧丝）进行分子鉴定，以 确定合成与分泌的蚕丝具有杂交优势的蛋白质，但目前还没有方法能从分子水平上进行鉴 定。
技术实现思路
针对目前的研究现状，本专利技术主要解决的技术问题是提供一种用于天然彩色蚕品 种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段及其制备方法，通过对白色茧丝的家蚕和天然彩色茧丝的柞 蚕、天蚕等丝素蛋白基因的分析，克隆了源于蚕新品种亲本的典型的肽段基因序列，包括家 蚕丝Η链非结晶区基因、Η链结晶区与非结晶区的重组基因；柞蚕、天蚕蚕丝Η链基因；构建 了大肠杆菌表达载体，获得了相应肽段的表达产物（蚕丝蛋白肽段-用于抗体制备相应的 抗原）。获得的产物用于进一步制备高精确度的蚕丝抗体。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是： -种用于天然彩色蚕品种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段，其基因序列包括家蚕丝Η 链非结晶区基因、Η链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧柞蚕、天蚕蚕丝Η链基 因。 所述的家蚕丝Η链非结晶区基因的非重复序列肽段的编码基因序列为 SGFGPYVANGGYSGYEYAffSSESDFAG 〇 所述的天蚕丝素蛋白重链氨基酸编码基因序列为SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-)。 所述的丝蛋白肽段的制备方法，具体包括家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表 达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表 达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与与表达。 一、家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列（图1)及其 编码基因信息，设计并合成（Invitrogen公司）了非重复序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的编码基因序列。基因序列的5'端和3'端分别含有Hindlll和Bglll的 粘末端碱基，紧接其5'粘末端下游设计了限制性核酸内切酶NgoMIV的识别位点，紧接3' 粘末端上游设计了限制核酸性内切酶Agel的识别位点，后2个酶切位点用于与结晶区基因 进行重组。选择实验室保存的含常用多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的克 隆，用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如图1)，插入设计合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区 编码基因的质粒pSL-F(l)。 B、实验室保存有pGEX-Agel载体，由pGEX-KG经过改造加入了限制性核酸内切酶 Agel 位点（王建南，等。MaterialsScienceandEngineeringC, 2014, 34:429 - 436)。Agel/ HindllI酶切pGEX-Agel载体回收载体片段，Agel/HindllI酶切质粒pSL-F (1)回收插入片 段，T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为pGEX-F(l)。 C、构建的表达载体表达外源蛋白时具有谷胱甘肽S-转移酶（GST)的标签，表达的 产物融合蛋白记为GST-F(l)。将构建的表达载体pGEX-F(l)转入大肠杆菌BL21菌细胞， 加入0-1. 2mM的诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的 空气摇床中诱导培养0-8小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的 BL21菌细胞。 D、菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打匀、煮沸5min，13300r/min的速度离心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴 酚蓝指示剂到达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。 E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-F(l)。纯化后收集的各管融合蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合 蛋白经凝血酶酶切，再经GST亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蚕丝H链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链基因片段。

【技术特征摘要】
1. 用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蚕丝H 链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链 基因片段。2. 根据权利要求1所述的丝蛋白肽段，其特征在于，所述的家蚕丝H链非结晶区基因构 建的表达载体为PGEX-F(I)，所述的H链结晶区与非结晶区的重组基因构建的表达载体为 pGEX-gsl6fl，所述的天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链基因片段的表达载体为pGEX-AYR4。3. -种制备如权利要求1或2所述的丝蛋白肽段的方法，其特征在于，包括家蚕品种蚕 丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因 的克隆、表达载体构建与表达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达。4. 如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的家蚕品种蚕丝非 结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、 对Invitrogen公司合成的家蚕品种蚕丝非结晶区基因的非重复序列肽段F(I)的编 码基因序列，基因序列的一端设计有限制性核酸内切酶HindIII-Ng 0MIV位点，另一端设计 有AgeI-BglII位点，用已经保存的含多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的 克隆，用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA，插入设计合成的含有BglII 和HindIII的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区编码 基因的质粒PSL-F(I); B、 由pGEX-KG经过改造加入限制性核酸内切酶AgeI位点得pGEX-Agel，Agel/Hindlll 酶切的PGEX-AgeI载体回收载体片段，Agel/Hindlll酶切质粒[pSl^F (1)回收插入片段， T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为pGEX-F(l); C、 将构建的表达载体pGEX-F (1)转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的诱导剂异 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养0-8小 时，然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞； D、 菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心 IOmin,收集上清液； E、 将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋白 GST-F(I)； F、 采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋白经 凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽F (1)。5. 如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的家蚕品种蚕丝结 晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、 用AgeI酶切（GA) 16的质粒插入NgoMIV和AgeI酶切获得的F(I)的基因序列，筛选 F(I) 3'端AgeI与NgoMIV粘末端的连接进行克隆，连接后酶切位点消失，形成Ala和Gly， 同时完成了家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆，所使用的克隆载体为冻存的 pCDNA-2,构建的质粒为 pCDNA-gsl6fl ; B、 用核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化质粒pGEX-Agel回收条带作为载体片段， 同时用所述的核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化上述构建好的结晶区肽段与非结晶区 肽段的重组质粒，并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建 pGEX系列表达载体，S卩pGEX-gsl6fl，编码的氨基酸序列为GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGAGSGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建南，裔洪根，褚永兴，
申请(专利权)人：湖州南浔恒岳农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33