本发明专利技术公开了一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，属于纳米材料生物有效性的检测技术领域。本发明专利技术的步骤包括细菌荧光品系构建，将载有荧光蛋白的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程，将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体分散在有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测，检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定，对上述步骤中培养的细菌吸光值和克隆形成数目进行测定。本发明专利技术通过使用细菌作为研究对象，对纳米材料的生物有效性进行快速检测，解决了以往纳米材料生物有效性评价过程耗时长、有效剂量浓度范围难以确定的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米材料生物有效性的检测
，更具体地说，涉及。
技术介绍
纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-1OOnm)或由它们作为基本单元构成的材料，这大约相当于10?100个原子紧密排列在一起的尺度。纳米金属材料是20世纪80年代中期研制成功的，后来相继问世的有纳米半导体薄膜、纳米陶瓷、纳米磁性材料和纳米生物医学材料等。人工纳米材料是目前在材料学、工程学和医学领域广泛应用的一种先进材料，纳米技术在新世纪将推动信息技术、医学、环境科学、自动化技术及能源科学的发展，像抗生素、集成电路和人造聚合物在二十世纪发挥了重要作用一样，纳米技术在新世纪将人类的生活带来深远影响。其中，人工纳米材料在医学上的应用异常广泛而重要，如核磁共振成像技术、细胞分离和染色技术、作为药物或基因载体、生物替代纳米材料、生物传感器等很多领域。 然而，科学家在对人工纳米材料的安全性评价中发现，根据其剂量差异，存在不同的毒理学效应。在一定的剂量范围内，人工纳米材料可有效的促进功能蛋白的表达，从而可以应用到抗体的制备中，以及在使用纳米材料作为药物输送的载体中，调节其使用剂量可以很好地增强免疫应答，提高疗效的效果，但另一方面，据美国纽约罗切斯特大学研究人员的实验显示，实验白鼠吸入纳米材料可能对多个脏器和中枢神经系统产生不良影响。进入21世纪，我国开始高度关注纳米生物效应与安全性的研究。纳米材料在创造巨大经济效益的同时，其毒性和健康效应也开始弓I起人们的关注。 中国专利申请号为2011104279814，申请日为2011年12月19日，专利技术创造名称为:一种评价膳食铁生物有效性的改良模型及其建立方法，该申请案包括模型结构，细胞种类和评价指标，所述的模型结构中设置有插入槽，Caco-2细胞培养位置设置在插入槽底膜上，模型结构具备顶侧室和基底侧室；该申请案采用的模型是使用细胞评价膳食中铁的吸收和转运过程，拟解决铁转运和吸收过程中的问题，未曾考虑铁元素的毒理学效应、剂量效应和作为载体转运药物的问题。中国专利号ZL2008102024518，申请日为2008年11月10日，专利技术创造名称为:一种降低活性污泥中重金属生物有效性的方法，该专利涉及一种活性污泥中重金属的处理工艺，根据活性污泥中所含重金属种类和含量，往活性污泥中添加其重量的7% -70%的粉末腐殖土，室温下均匀搅拌20-30天后，活性污泥中Zn、Cu、N1、Pb四种重金属可交换态和碳酸盐结合态的比例降低1.4-7倍，Zn、Cu、N1、Pb四种重金属硫化物及有机质结合态和残渣态的比例得到提高，使活性污泥中重金属的生物有效性得到降低；该专利技术采用的降低活性污泥中重金属生物有效性的方法，在解决生物污泥中的重金属含量，并不是针对生物医学领域金属纳米材料作为药物传递载体的有效性评价。中国专利申请号为2012105483964，申请日为2012年12月17日，专利技术创造名称为:基于生物有效性的土壤Cd污染的植物修复，该申请是一种利用大生物量非超富集蔬菜生菜修复治理Cd污染土壤的方法，该申请利用大生物量非超富集蔬菜生菜吸收富集Cd污染土壤中有效态Cd，并向上转运到地上部，当生菜生长到成熟期将生菜整体移除并作为日常食用蔬菜使用，从而达到保证蔬菜品种的同时治理污染土壤；通过生菜的种植，重复上述过程，就可以连续提取污染土壤中的Cd，直到其含量达到环境安全标准；该方法采用的污染环境植物修复的方法，在使用生菜富集土壤中的Cd离子的含量，以去除土壤中Cd离子为主要研究目的，而不是研究适用于功能蛋白表达的有效性评价。 由此可见，对作为药物载体的纳米材料，缺乏适当的方法检测其对生物样品功能蛋白表达的检测方法及适当剂量范围的生长繁殖相关评价，作为指导纳米材料作为药物载体的重要参照。因此研制一种简单快速地评估纳米材料生物有效性的方法，且同时能够提高功能蛋白的表达和生长繁殖速率，具有非常重要的应用价值，同时也是一个技术难点。本专利技术正是针对上述问题，着重围绕功能蛋白表达和生长繁殖等方面进行了改进。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题 本专利技术的目的在于解决现有技术中关于人工纳米材料对生物样品功能蛋白表达的检测方法及适当剂量范围的生长繁殖相关评价方法缺乏的不足，提供了。采用本专利技术的技术方案，通过使用细菌作为研究对象，对纳米材料的生物有效性进行快速检测，解决了以往纳米材料生物有效性评价过程耗时长、有效剂量浓度范围难以确定的问题。 2.技术方案 为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为: 本专利技术的，其步骤包括细菌荧光品系构建、纳米材料的生物样品暴露过程、荧光蛋白的表达检测和细菌的生长繁殖水平测定；其中，细菌荧光品系构建步骤包括将载有荧光蛋白的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程步骤包括将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体在分散有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测步骤包括检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定步骤包括对上述步骤中培养的细菌克隆形成数目的计数。 作为本专利技术的进一步改进，快速检测纳米材料生物有效性的方法步骤具体如下: 步骤一、细菌荧光品系的构建 使用绿色荧光蛋白-GFP作为功能蛋白表达量的标记，将绿色荧光蛋白-GFP插入特异性功能蛋白的启动子序列，其中，绿色荧光蛋白-GFP所插入位点为保守持家基因的启动子；然后将载有绿色荧光蛋白-GFP的PUC19质粒转入细菌体内，将PUC19质粒插入细菌持家基因的启动子序列之后，挑取性状稳定的个体以作后续研究； 步骤二、纳米材料的生物样品暴露过程 实验组将纳米材料以一定浓度分散在PBS缓冲液中，以1:10的体积比将分散有纳米材料的PBS缓冲液稀释到LB培养基中，对照组加入同样体积的PBS缓冲液但不含有纳米材料，同样以1:10的体积比将PBS缓冲液稀释到LB培养基中，同时对实验组和对照组接入同等数量的步骤一中挑取的细菌荧光品系开始进行细菌的纳米材料暴露过程；本步骤的培养过程在37摄氏度的培养箱中进行，以150-200rpm的速度进行4_6小时的生长和繁殖培养。 步骤三、荧光蛋白的表达检测 在载有绿色荧光蛋白-GFP的细菌荧光品系经过上述步骤二纳米材料处理之后，将实验组与对照组的菌株以1:20的比例稀释到PBS缓冲液中，进行共聚焦显微镜的镜检；通过激光器的荧光激发，观测荧光强度与荧光的分布，对比绿色荧光蛋白的表达情况。 步骤四、细菌的生长繁殖水平测定 将步骤二得到的实验组和对照组的细菌按同样倍数稀释后对涂到90mm培养皿中，经过37摄氏度培养8小时后对形成的克隆数进行计数。 作为本专利技术的进一步改进，所述的细菌为大肠杆菌，所述的细菌荧光品系为将载有绿色荧光蛋白-GFP的PUC19质粒转入大肠杆菌trans-Ι中获得的性状稳定的个体。 作为本专利技术的进一步改进，步骤三中所述激光器的荧光为488nm。 作为本专利技术的进一步改进，所述的细菌的生长繁殖水平测定还可以采用测定600nm处吸光值的方法对细菌的数目进行测定。 作为本专利技术的进一步改进，PBS缓冲液制备过程如下:准确称量KC10.2g，KH2PO40.2g，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于：其步骤包括细菌荧光品系构建、纳米材料的生物样品暴露过程、荧光蛋白的表达检测和细菌的生长繁殖水平测定；其中，细菌荧光品系构建步骤包括将载有荧光蛋白的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程步骤包括将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体在分散有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测步骤包括检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定步骤包括对上述步骤中培养的细菌克隆形成数目的计数。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于:其步骤包括细菌荧光品系构建、纳米材料的生物样品暴露过程、荧光蛋白的表达检测和细菌的生长繁殖水平测定；其中，细菌荧光品系构建步骤包括将载有荧光蛋白的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程步骤包括将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体在分散有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测步骤包括检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定步骤包括对上述步骤中培养的细菌克隆形成数目的计数。2.根据权利要求1所述的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于:其步骤具体如下: 步骤一、细菌荧光品系的构建 使用绿色荧光蛋白-GFP作为功能蛋白表达量的标记，将绿色荧光蛋白-GFP插入特异性功能蛋白的启动子序列，其中，绿色荧光蛋白-GFP所插入位点为保守持家基因的启动子；然后将载有绿色荧光蛋白-GFP的PUC19质粒转入细菌体内，将PUC19质粒插入细菌持家基因的启动子序列之后，挑取性状稳定的个体以作后续研究； 步骤二、纳米材料的生物样品暴露过程 实验组将纳米材料以一定浓度分散在PBS缓冲液中，以1:10的体积比将分散有纳米材料的PBS缓冲液稀释到LB培养基中，对照组加入同样体积的PBS缓冲液但不含有纳米材料，同样以1:10的体积比将PBS缓冲液稀释到LB培养基中，同时对实验组和对照组接入同等数量的步骤一中挑取的细菌荧光品系开始进行细菌的纳米材料暴露过程；本步骤的培养过程在37摄氏度的培养箱中进行，以150-200rpm的...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗勋，王云，王顺昌，
申请(专利权)人：淮南师范学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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