一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-cyp153a制造技术

本发明专利技术涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。本发明专利技术利用现代生物工程技术，采用合成alkB2基因；并选择柴油降解率低的海洋土著菌Y8，构建了Y8-alkB2基因工程菌。经过鉴定，确定Y8属于克雷伯氏菌属；Y8-alkB2含有alkB2转基因片段，能表达ALKB蛋白。对该基因工程菌的降解率的测定和降解条件的分析，显示该基因工程菌株能有效提高土著菌Y8的柴油降解效率，稳定、高效地对柴油污染物进行降解，有望应用于海水柴油污染的治理。

【技术实现步骤摘要】
,8-cypl53a的制作方法【专利摘要】本专利技术涉及一株能降解海水柴油污染物的基g工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。本曼明利用现代生物工程技术，采用合成alkB2基a;并选择柴油降解率低的海洋土著菌Y8，构建TY8-alkB2基因工程菌。经过鉴定，确定Y8属于克雷伯氏菌属；Y8-alkB2含有alkB2转基因片段，乾表达ALKB蛋白。对该基因工程菌的降解率的测_和降解条件的分析，显示该基因工程菌株能有玫提高土著菌Y8的柴油降解效率，稳定、高效地(寸柴油污染物进行降解，有望应用于海水柴油污&的治理。【专利说明】-株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-cyp153a 1
本专利技术涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力 的测定。 2
技术介绍
生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环 境污染的受控或自发过程，是在生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术，其中，微生物 降解是生物修复去除环境中石油污染物的主要途径。 土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低，因 而转入外源高效污染物降解基因，能够提高生物修复效率。近年来，构建高效的基因工程菌 以显著提高污染物的降解效率成为油类污染治理的一个热点，为解决生物修复周期长等问 题提供了崭新的途径。国外学者Charkrabany经过研究发现能降解芳烃、萜烃、多环芳烃的 细菌的降解基因位于质粒上，根据质粒容易传递的特性将能够降解脂（含质粒A)的一种假 单胞菌作为受体细胞，分别将能够降解芳烃（含质粒B)、萜烃（含质粒C)、多环芳烃（含质 粒D)的质粒，用遗传工程的方法人工转入受体细胞，获得多质粒的"超级细菌"，这一新型 菌能同时降解四种石油组分，能把原油中约2 / 3的烃类消耗，其突出的优点是比自然菌降 解速度快。 烷烃降解菌的降解酶基因中P450家族的CYP153亚族是目前的研究热点。烷烃 进入细菌后，先被细胞质中的CYP153A蛋白进行末端羟基化，然后在乙醇脱氢酶和乙醛脱 氢酶的作用下进一步氧化，最后加上乙酰辅酶A，进入β氧化循环，分解成二氧化碳和水， CYP153Α酶是烷烃降解的限速酶。 某些微生物能以烷烃为碳源已被公认，但大多数生化和遗传研究主要还是集 中在有限的几个原型系统，Alcanivorax borkumensis烧经轻化酶系统是其中之一， Alcanivorax borkumensis是海洋微生物中一种独特的、以烧经为主要的特异性底物生 长的杆状Y-蛋白菌。该菌遍布全球众多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中国沿海 和北极。在没有污染的海洋中，该菌数量很少，但在石油污染的开发海域或海岸，该菌可 快速生长成为污染水域中的优势菌群，在石油降解菌群中，该菌所占比例为80-90%。近 期研究报道证明A. borkumensis在石油污染生物修复中发挥关键作用。2006年，Nature Biotechnology报道了 A. borku-mensis SK2的基因组全长序列及其功能分析结果，发现该 菌基因组中含有多个编码烃类物质分解代谢酶系统的基因簇，如alkSBIGJH基因簇，gntR 和alkB2, p450等。这些基因编码的蛋白在η-烷烃转变成脂肪酸的过程中发挥重要作用。 由于CYP153A蛋白是细菌中氧化中链烷烃的主要酶系统之一，也是使A. borku-mensis SK2 具备更强的经类降解能力的重要因素，因此，本专利选择Alcanivorax borkumensis SK2的 cyp 153a基因作为目的基因，构建基因工程菌，以期解决土著菌降解效率低的难题。 3
技术实现思路
本专利技术的目的是制备获得一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，使其降解能 力较土著菌大幅度提高。 Y8菌是采用富集培养微生物的方法，从定海港口受污染的海水中分离获得的对油 类污染降解效率较低的土著菌，但能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖。经紫 外分光光度法检测，其对柴油污染物的7天降解效率仅为10?15%。 对Y8菌株直接进行菌落PCR扩增，得到16S rDNA的基因序列，构建系统发育树， 结果表明Y8菌株与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99%，由此可 确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182所构的支为姐妹群关系。 提取Y8基因组和土著质粒，经PCR分析得知Y8中不含有cyp 153a基因。而cyp 153a 酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因转导的方法，在Y8中转入cypl53a基因，构建基 因工程菌Y8-cypl53a。 经鉴定，Y8-cypl53a能特异表达CYP153A蛋白，对柴油的降解率分别为：2天， 15. 59% ;4 天，38. 17% 以及 6 天，60. 47%。 4【专利附图】【附图说明】 图I :Y8菌株的菌落及菌体形态A :Y8在营养平板上生长的菌落；B :Y8菌体形态； C :电镜下Υ8菌体形态。 图2 :根据Y816s rDNA序列构建的系统发育树。 图3 :Y8菌株基因组和质粒抽提及其cypl53a基因表达的PCR鉴定：P-质粒；G-基 因组。 图4 :pCom8_cypl53a质粒的鉴定（质粒大小、PCR和酶切鉴定）。 图5 :Y8-cypl53a菌株中质粒抽提及酶切、PCR和蛋白表达鉴定。 图6 :Y8与Y8_cypl53a菌株对柴油的降解效率比较。 5【具体实施方式】 以下通过具体实施对本专利技术做进一步说明。 实施例1.柴油污染海水中细菌的富集、培养 从受柴油污染的海水区域采集表层水样，用灭菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表层海 水后密封保存，24h内进行微生物的富集培养和分离工作。 将采集的水样取ImL接种于含0.5 % (V / V)柴油的IOOmL灭菌的人工海水 培养基（MMC)中。MMC 的配方为（每升含量）：NaC124g ;MgS04 · 7H200. 7g ;NH4N031g ;K CIO. 7g ;KH2P042g ;Na2HP04 · 12H203g ;pH7. 5,灭菌后补加适量微量元素混合。微量元素经 0· 22gm滤膜过滤除菌，其组成（每升含量）如下：CaC122mg ;FeC136H2050mg ;CuS040. 5mg ; MnC12 · 4H200· 5mg ;ZnS04 · 7H2010mg / L。在 30°C，200r / min 的摇床培养 7 天后，从培 养液中取出ImL转入IOOmL新鲜培养基中，培养基的油浓度提高至I % (v / v)，在相同的 条件下培养；油浓度按梯度（〇. 5%、1 %、1. 5%、2%、2. 5% )提高，富集培养五个周期。 实施例2· Y8菌株的分离 用移液枪（枪头已灭菌）吸取ImL富集培养物置于9mL无菌水中，作为10-1稀 释液进行倍比稀释，分别制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液；分别吸取 0. 2mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂布8个平板，对应编号，倒置于35本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8‑cyp153a，其特征是土著菌Y8转入一段P450家族的cyp153a基因片段，该基因工程菌能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，提高土著菌Y8的柴油降解率。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何颖，刘琼，沈先荣，王庆蓉，李珂娴，侯登勇，蒋定文，刘玉明，陈伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军医学研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31