母乳脂肪酸谱数据库的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：取多个母乳样品；将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相；将所述有机相注入SPE固相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE同相萃取小柱，收集流出液，N2吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯；利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到每个母乳样品中各类脂肪酸的含量；建立母乳脂肪酸谱数据库。本发明专利技术提供的母乳脂肪酸的测定方法，能够快速、准确地测定母乳脂肪酸的含量，了解不同人群哺乳期母乳脂肪酸种类和含量的变化特征，从而建立母乳脂肪酸谱数据库，指导我国企业生产出真正适合中国婴儿的配方奶粉。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，包括以下步骤：取多个母乳样品；将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相；将所述有机相注入SPE固相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE同相萃取小柱，收集流出液，N2吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯；利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到每个母乳样品中各类脂肪酸的含量；建立母乳脂肪酸谱数据库。本专利技术提供的母乳脂肪酸的测定方法，能够快速、准确地测定母乳脂肪酸的含量，了解不同人群哺乳期母乳脂肪酸种类和含量的变化特征，从而建立母乳脂肪酸谱数据库，指导我国企业生产出真正适合中国婴儿的配方奶粉。【专利说明】
本专利技术涉及脂肪酸含量测定领域，尤其涉及一种。
技术介绍
母乳是婴儿成长唯一最自然、最安全、最完整的天然食物，其营养丰富，含有婴儿成长所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和抗体等物质，易于吸收和利用，能够保证婴儿的健康成长。特别是，母乳中含有的百分之五十的脂肪，除了能够提供婴儿身体日常消耗的热量外，还能满足婴儿脑部发育所需的脂肪。母乳可提供婴儿自身体内不能合成的必需脂肪酸(essential fatty acid, EFA),如亚油酸(linoleic acid, LA)和 α-亚麻酸(linoleic acid,LNA)以及一些长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturatedfatty acid, LC PUFA),如花生四烯酸(arochidonic acid, AA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA),它们对于婴儿的生长发育有着重要的意义,尤其是后者对婴儿中枢神经系统发育的作用越来越引起人们的重视。 然而，母乳中的微量和常量营养素是会随着哺乳的进行以及乳母饮食改变而发生变动的，母乳中的某些脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)等会随乳母饮食的变化而变化。母亲饮食中补充鱼油或DHA能够使母乳中的DHA含量显著升高，母乳中的其它脂肪酸成分也都受到了不同程度的膳食影响。 我国目前所有的婴儿配方奶粉都是模仿西方大品牌的产品配制的。不同民族不同饮食方式的人群对食物的应答不同，不同国家哺乳妇女由于遗传背景和饮食状况的不同，母乳中部分成分也不相同，如脂肪酸成分与含量就有着显著的不同，即使在同一个国家，不同地区由于环境和饮食习惯的不同，母乳脂肪酸成分及含量同样存在较大的差异。对婴儿而言，如果母亲由于种种原因不能用母乳喂养婴儿，那么一种与母乳成分相同的配方奶粉是最安全、最健康、最理想的选择。 在中国人群中，尚没有建立母乳脂肪酸谱数据库的快速、准确测定的方法，建立此方法对于构建不同地区人群的母乳脂肪酸谱数据库，了解中国不同地区人群母乳的特点和哺乳期母乳脂肪酸的变化特征，指导我国企业以母乳脂肪酸谱数据库为基础，生产出真正的适合中国婴儿的配方奶粉具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种能够实现母乳脂肪酸含量快速、准确测定，建立母乳脂肪酸谱数据库的方法。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案是: 一种，包括以下步骤: (I)取多个母乳样品； (2)将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相； (3)将所述有机相注入SPE同相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE固相萃取小柱，收集流出液，N2吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯； (4)利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到母乳样品中各类脂肪酸的含量； (5)建立母乳脂肪酸谱数据库。 所述酯化反应包括:将母乳样品、甲醇/苯溶液混合均匀，加入乙酰氯，水浴加热反应，反应完成后加入可溶性碳酸盐，中和混合液。 所述母乳样品、甲醇、苯和乙酰氯的体积比为:1: 16: 4: 2。 所述水浴加热反应的温度为80?100°C，时间为I?2小时。 所述SPE固相萃取小柱为聚酰胺柱，柱容量为500mg。 所述洗脱液为乙醚-正己烷。 所述气相色谱采用安捷伦DB-23色谱柱。 所述气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱的分析条件为:进样口温度:270°C，进样体积:2μ L，检测器温度:270°C，载气:N2，流速:2.30mL/min，气体配比:氮气:氢气:空气为20: 7: 5，柱温:140°C，柱温升温程序:140°C，保持2min，以10°C/min升至160°C，保持2min ;以 10°C /min 升至 22CTC,保持 4min ;以 10°C /min 升至 24CTC,保持 6min。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果: (I)传统方法需对样品进行24小时浸提，并且需通过过滤与旋转蒸发获得脂肪酸才能进行甲酯化，而本专利技术方法只需采用甲酯化的一步法即可完成测定，无需浸提。本专利技术提供的母乳脂肪酸测定方法与传统甲醇/氯仿测定法相比，能够缩短测定时间，减少试剂消耗。此外，本专利技术方法无需使用氯仿，可以避免其对人体造成的损害。 (2)本专利技术提供的母乳脂肪酸的甲酯化法以及脂肪酸甲酯的纯化和色谱检测方法，能够快速、准确地测定母乳脂肪酸的含量，了解不同人群哺乳期母乳脂肪酸种类和含量的变化特征，从而建立母乳脂肪酸谱数据库，指导我国企业生产出真正适合中国婴儿的配方奶粉。 【专利附图】【附图说明】 图1为31种脂肪酸混合标样的GC分析结果图； 图2为采用本专利技术方法获得的初乳中脂肪酸的GC分析结果图； 图3为采用本专利技术方法获得的二周乳中脂脂肪酸的GC分析结果图； 图4为采用本专利技术方法获得的六周乳中脂肪酸的GC分析结果图； 图5为本专利技术方法与传统方法测定脂肪酸含量的差异比较； 图6为采用本专利技术方法获得的不同哺乳时期母乳脂肪酸含量及比例； SFA:饱和脂肪酸；MUFA:单不饱和脂肪酸；PUFA:多不饱和脂肪酸；n_3PUFA:n_3多不饱和脂肪酸；n-6PUFA:n-6多不饱和脂肪酸脂肪酸。 【具体实施方式】 实施例1 一、母乳的采集 选择提供母乳的产妇标准为:年龄20-40岁，身体健康，不抽烟，刚生育单胞胎，且产后第一个月全母乳喂养。采集样本前收集产妇的24小时饮食调查问卷，包括产妇的身高、体重、血压等数据。分别在兰州、北京、杭州地区的城市和农村征集50名产妇，并收集其初乳、二周乳、六周乳，用于母乳脂肪酸的测定。 母乳总样本数为1234例，其中初乳477例，二周乳385例，六周乳372例。杭州地区样本总数为518例，其中初乳202例，二周乳166例，六周乳150例；北京地区样本总数为332例，其中初乳133例，二周乳93例，六周乳106例；兰州地区样本总数为384例，其中初乳142例，二周乳126例，六周乳116例。 产妇母乳取量为30mL，分装于1.5mL冻存管中，于-40?-80°C储存待用。可采用常温下解冻、流水解冻或冰浴下摇床震荡解冻的方法从冻存管中提取母乳。 二、母乳样品的甲酯化 采用乙酰氯-甲醇甲酯化法进行母乳脂肪酸的甲酯化，并提取和纯化母乳脂肪酸甲酯物。甲酯化后得到的产物是不同脂肪酸甲酯，此处统称为脂肪酸甲酯。 具体步骤如下: (I)向1mL体积的螺口试管中加入100 μ L母乳和2.0mL的4:1 (ν/ν)甲醇:苯混合溶液，充分混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种母乳脂肪酸谱数据库的建立方法，包括以下步骤：(1)取多个母乳样品；(2)将每个母乳样品与甲醇进行酯化反应，反应完成后，将反应液离心，取上层有机相；(3)将所述有机相注入SPE固相萃取小柱，用洗脱液淋洗SPE固相萃取小柱，收集流出液，N2吹干，获得纯化的脂肪酸甲酯；(4)利用气相色谱采集脂肪酸甲酯图谱，采用归一法计算得到母乳样品中各类脂肪酸的含量；(5)建立母乳脂肪酸谱数据库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李铎，吴珂剑，谢宏，俞祖勋，任一平，赵逸民，
申请(专利权)人：浙江大学，贝因美婴童食品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33