本实用新型专利技术公开了一种电化学免疫传感器，其电极表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，所述抗体优选单克隆抗体，所述传感器优选含有双层纳米金膜，其电极优选玻碳电极，是以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。该传感器可用于检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏菌，其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本技术公开了一种电化学免疫传感器，其电极表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，所述抗体优选单克隆抗体，所述传感器优选含有双层纳米金膜，其电极优选玻碳电极，是以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。该传感器可用于检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏菌，其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。【专利说明】一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器
本技术涉及生物免疫检测
，特别是涉及一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器。
技术介绍
随着单克隆抗体杂交瘤技术日益广泛的应用，需要对获得的单克隆抗体(McAb)进行系统地分析鉴定，以确定其在各种免疫学试验中的价值。除了对McAb的免疫球蛋白链理化性质进行分析外，测定McAb结合抗原的特异性、解离平衡常数KD、结合亲和力Km及解离速率常数Kdis对选择合适的McAb用于某一特定目的十分重要。生物分子相互作用仪采用生物薄膜干涉(B1-Layer Interferometry,BLI)技术,无需标记,具有高灵敏度、高通量等特点，可以作为检测抗原抗体之间亲和力的工具。自2004年问世以来，在抗原与抗体互作、小分子与蛋白互作、蛋白分子与蛋白分子互作及药物筛选等方面发展迅速，受到越来越多的关注。 沙门氏菌(Salmonella)是一种可以引起沙门氏菌病的革兰氏阴性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一。据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。志贺氏菌(Shigella)也是一类具有高度传染性的肠道致病菌。根据WHO统计有1.647亿人感染痢疾，1.1万人死亡，其中多数为5岁以下的儿童。在成年患者中，10?10cfu志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发炎症反应。目前，食品中沙门氏菌的检测方法仍采用传统的国标法GB4789.4-2010，食品中志贺氏菌的检测方法采用传统的国标法GB4789.5-2012，上述方法是目前世界各国普遍接受的标准方法，鉴定结果准确可靠。但是由于菌种有上千种血清型，生化特性各异，使其检验程序十分复杂繁琐，由于检测时需要反复进行细菌培养，因此至少需要4?7d才可得到准确的检测结果。近年来，国内外对于沙门氏菌、志贺氏菌的检测有了一些新的进展，主要为基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技术、生物薄膜干涉(B1Layer Interferometry, BLI)技术、PCR技术、荧光标记技术和酶联免疫技术(ELISA)等的快速检测方法。但PCR、SPR、BLI仪器设备要求精度高、价格昂贵，不能实现在线检测，且对试验操作人员要求严格；而荧光标记技术及ELISA只能进行定性或半定量，再加上数据处理和加样方式的限制，要实现即时、准确定量和在线检测几乎是不可能的。电化学分析具有不受样品的浊度、颜色的影响，所需设备仪器相对简单的特点以及酶促反应的高效性、免疫分析无需对样品进行纯化、富集等预处理的特点，可以较好成为沙门氏菌及志贺氏菌的检测平台。 苏氨酸憐酸裂合酶(phosphothreoninelyase)是以 SpvC(Salmonella plasmidvirulence C)为代表的(包括Outer shigella protein F,OspF) 一类新的酶效应蛋白家族，由沙门氏菌及志贺氏菌通过III型分泌系统特异性分泌，因此可以作为检测两种菌的标志物。当它注入到宿主细胞后，不可逆灭活宿主丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs),破坏宿主的先天免疫防线,导致的急性炎症。研究发现在导致细菌性痢疾的菌种都能通过III型分泌系统分泌SpvC。本技术拟以苏氨酸磷酸裂合酶为抗原制备抗-SpvC单克隆抗体，利用抗原抗体之间特异性结合作用检测苏氨酸磷酸裂合酶，从而间接达到检测沙门氏菌及志贺氏菌的目的；本技术拟通过BSI筛选出与抗原蛋白亲和力更强的抗-SpvC单克隆抗体株以用于苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。
技术实现思路
本技术的目的是为解决现有技术中所存在的缺陷，专利技术的一种灵敏度高、特异性强、快速定量测定沙门氏菌及志贺氏菌的电化学免疫传感器。 为实现上述目的，本技术提供一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器，其特征在于，其电极表面是包住电极的壳聚糖凝胶层，壳聚糖凝胶层之上是纳米金溶胶层，纳米金溶胶层之上为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层，抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层之上在电极中心位置为硫堇/壳聚糖聚合物膜，其上为纳米金/辣根过氧化物酶层，最上层为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层。 所述抗体为多克隆抗体。 所述抗体为单克隆抗体。 所述电极为玻碳电极。 所述传感器以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体。 所述传感器以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。 一方面，本技术还提供所述的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤: I)抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体的制备； 2)玻碳电极的预处理； 3)纳米金溶胶的制备； 4)硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物的制备； 5)纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备； 6)苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。 所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。 与现有技术相比，本技术的有益效果是: 本技术以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于上述电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体(所述抗体优选单克隆抗体)，构建了双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器，于此形成的良好的信号放大系统使其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。 【专利附图】【附图说明】 图1为本技术的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备示意图。 【具体实施方式】 以下实施例用于说明本技术，但不用来限制本技术的范围。 实施例1传感器的制备 1、抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选 首先，采用常规单克隆抗体制备方法，将来源于沙门氏菌的SpvC蛋白抗原注射Balb/C小鼠，得到单克隆抗体株，再腹腔注射Balb/C小鼠，纯化腹水即得抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体。 然后，进行抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选:采用美国ForteB1公司生产的生物分子相互作用仪Octet Red96进行本实验:取五只Protein A传感器A3、B3、C3、D3、E3，五个浓度梯度苏氨酸磷酸裂合酶蛋白抗原与之一一对应，浓度分别是:4μΜ，1.3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器，其特征在于，其电极表面是包住电极的壳聚糖凝胶层，壳聚糖凝胶层之上是纳米金溶胶层，纳米金溶胶层之上为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层，抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层之上在电极中心位置为硫堇/壳聚糖聚合物膜，硫堇/壳聚糖聚合物膜上为纳米金/辣根过氧化物酶层，最上层为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庞广昌，鲁丁强，耿利华，
申请(专利权)人：北京盈盛恒泰科技有限责任公司，
类型：新型
国别省市：北京;11
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