一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜技术

本发明专利技术属于显微扫描技术领域，公开了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；两路扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光，投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，两路扫描激光同步扫描，产生光片激发样品，投射方向为x轴方向；扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；两路扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；两路扫描激光的扫描方向相反。本发明专利技术通过采用双光束扫描激光对透明样品进行光片照明成像，以期获得更高的成像速率；通过图像频域权重叠加提升成像质量。

【技术实现步骤摘要】
一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜
本专利技术涉及显微成像
，特别涉及一种双光束光片照明显微扫描成像方法及显微镜。
技术介绍
光片照明显微镜是利用微米级的激发光薄片激发样品的荧光，用全场探测的方式实现样品的快速荧光信号探测。光片照明显微成像采用了线状照明取代传统的点扫描成像方式，因此它具有更高的成像速率，更高的信噪比以及更低的光漂白光毒性效应，适用于数小时甚至数天的活体生物成像。传统共聚焦光片照明显微成像技术受限于成像器件的曝光模式，这种扫描方式无法做到满帧速率的读出，且不能利用回程扫描的光束，因此极大限制了成像速率，进而限制了整体系统的成像速率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种提升成像速率光片照明显微成像技术。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括以下步骤：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；所述第一方向扫描激光和所述第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向相反。进一步地，所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，在扫描阵列的y轴正向边缘折返，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，在扫描阵列的y轴负向边缘折返，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描。进一步地，分别对第一方向扫描激光和第二方向扫描激光激发的样品荧光进行曝光输出的样品图像进行傅立叶变换，获取频域分布；将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。进一步地，所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面中线一侧的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面中线另一侧内的图像扫描。进一步地，投射在样品上的所述扫描激光呈线状。一种双光束光片照明显微镜，其特征在于，包括：照明单元，用于产生基于同光源的两路扫描激光并投射到样品相对的两侧面上；探测成像单元，用于探测收集扫描激光激发的样品荧光并曝光成像；控制单元，产生控制时序，控制照明单元进行扫描动作；同时控制探测成像单元进行荧光探测和图像曝光，并将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行图像叠加，获取完整图像；其中，所述控制单元设置样品移动结构，用于承载和移动样品。进一步地，所述照明单元包括：光源；分光结构，将光源输出的光信号分为两路等光强的两束扫描激光；光路转换结构，转换光路，将两路扫描光信号垂直投射在样品相对的两侧面上；其中，所述光路转换结构设置倒像装置，使一路所述扫描激光产生倒像。进一步地，所述探测成像单元包括：图像传感器；所述图像传感器为两块，分别探测收集两路扫描激光激发的样品荧光，并进行曝光成像，输出图像数据。进一步地，所述控制单元包括：控制器；所述控制器接收图像数据，进行图像重构；并生成控制时序，控制光源进行扫描动作；同时，驱动样品移动结构动作，移动承载样品；其中，图像重构是先将两路扫描激光激发样品荧光产生的两幅图像进行傅立叶变换，获取频域分布；再将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。进一步地，所述光源还包括：声光可调滤波器ATOF；所述ATOF连接在所述光源与分光结构之间，控制光源通断。本专利技术提供的双光束光片照明显微扫描成像方法通过双光束光片扫描样品相对的两侧获取样品图像信号；再将两路图像信号叠加获得样品的完整图像信号，从而实现满帧速率的数据采集，实现成像速度的倍增，大大提升成像；另一方面通过两侧交替照明，叠加图像信号的方式可以降低图像信号中背景的权重，从而降低背景的干扰大大提升图像成像的质量。附图说明图1为本专利技术实施例提供的双光束光片照明显微扫描成像技术的光路图；图2为本专利技术实施例提供的双光束光片扫描示意图；图3为本专利技术实施例提供的双光束光片扫描曝光示意图。具体实施方式本专利技术提供了一种双光束光片照明显微扫描成像方法，包括以下步骤：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；第一方向扫描激光和第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，第一方向扫描激光与第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向相反。本专利技术实施例提供的光片照明显微扫描成像技术为一种通过两束反向光束扫描产生光片，执行扫描的方法，针对透明样品；将光源投射到样品上，激发荧光，通过图像传感设备收集荧光进行图像曝光和图像重构。本实施例中，通过一个稳定光源分成两束呈光片的扫描信号：第一方向扫描激光和第二方向扫描激光，保证两路扫描激光属性相同，包括：频率、光强等。鉴于样品是透明的，通常样品经过前期加工，能够保有一定的厚度，通过光片扫描信号能够完整的获得图像信息；本实施例提供的方法，通过移动样品，调节样品的位置，获得多个局部的图形图像信息，之后重构形成三维立体图形信息。本实施例中，通过两侧扫描，获得两个独立的图形数据信号，分别独立曝光重构图像；鉴于两侧测量的背景不同，而样品本身结构一致，因此，两个图像信号叠加之后，会增强样品本身的图像信息权重，弱化背景区域的图像信息，从而提升图像质量，更为清晰地反映样品本身的信息。同时鉴于方法本身的原理要求，两路扫描信号同步扫描，从而基于同一时间坐标系，完整扫描过程，方便图像叠加的信息对应，避免重叠覆盖或者干扰遗漏。扫描激光投射到样品的方向为x轴方向，第一方向扫描激光和第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的投射方向相反；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；扫描激光的扫描方向为y轴方向；激发的样品的荧光采集方向为z轴方向；两束扫描光束从图像中线处分别向y轴正负方向执行扫描动作，从而针对两路激发荧光，从而提升扫描速度。通过图像传感器进行同步曝光时，进行滚动式行曝光，从而产生虚拟狭缝，阻挡焦平面以外的杂散光，保证图像质量。第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；第一方向扫描激光与第二方向扫描激光的扫描方向相反；两路扫描信号投射在样品上的初始位置为扫描阵面的中线处，通过扫描信号对样品进行线状激发，因此收集到的荧光也将获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于，包括以下步骤：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；所述第一方向扫描激光和所述第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向相反。

【技术特征摘要】
1.一种双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于，包括以下步骤：将同一光源输出的扫描激光分为第一方向扫描激光和第二方向扫描激光；所述第一方向扫描激光和所述第二方向扫描激光垂直投射在样品上，激发样品荧光；且所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向相反；探测收集样品上激发的荧光并曝光成像；移动样品，重复上述过程直到扫描获取完整的样品图像；其中，所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光同步扫描，且扫描速度一致；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的投射方向为x轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向为y轴方向；样品的荧光采集方向为z轴方向；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描初始位置为扫描阵面的中线处；所述第一方向扫描激光与所述第二方向扫描激光的扫描方向相反。2.如权利要求1所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，在扫描阵列的y轴正向边缘折返，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，在扫描阵列的y轴负向边缘折返，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面内的图像扫描。3.如权利要求2所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：分别对第一方向扫描激光和第二方向扫描激光激发的样品荧光进行曝光输出的样品图像进行傅立叶变换，获取频域分布；将两个图像进行基于频域分布的权重叠加，输出样品图像。4.如权利要求1所述的双光束光片照明显微扫描成像方法，其特征在于：所述第一方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴正向扫描，直至完成扫描阵面中线一侧的图像扫描；所述第二方向扫描激光自扫描阵面中线开始，沿y轴负向扫描，直至完成扫描阵面中线另一侧内...

【专利技术属性】
技术研发人员：付玲，杨哲，梅丽，龚辉，骆清铭，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42