嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术提供嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内结构域作为胞内结构域；编码所述嵌合抗原受体的核酸；表达所述嵌合抗原受体的细胞；和制备所述细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内结构域作为胞内结构域；编码所述嵌合抗原受体的核酸；表达所述嵌合抗原受体的细胞；和制备所述细胞的方法。【专利说明】嵌合抗原受体 技术背景 本专利技术涉及编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细胞，它们可用于肿 瘤的过继免疫基因治疗领域。
技术介绍
作为肿瘤的治疗策略，可以预期将能够结合特异性抗原的T细胞受体（TCR)的基 因引入任何T细胞，以制备靶向目标抗原的T细胞。根据该策略，已经尝试了过继免疫基因 治疗，其使用靶向许多肿瘤抗原的TCR基因，所述抗原例如，WT1、MART 1、gp 100、CEA、CD 19和 mHAG HA-2 抗原。 作为新的肿瘤过继免疫基因治疗，注意力已经集中在基因-修饰的T细胞治疗上。 基因修饰的Τ细胞治疗包括：将编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸引入Τ细胞，其中CAR对肿 瘤细胞表面抗原具有特异性并具有激活T细胞的能力；离体培养由此获得的引入基因的T 细胞；然后将所述细胞注入患者中。该治疗据信具有比抗体药物更强更持久的抗肿瘤效果， 并因此非常期待其临床效果。 CAR的代表性结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段（scFv)、跨膜结构 域和激活T细胞的TCR复合物⑶3 ζ的胞内结构域。具有这种构造的CAR称为第一代CAR。 单链可变片段部分的基因分离自例如产生识别靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。表达CAR的 T细胞独立于肿瘤细胞上的主要组织相容性抗原I型的表达而直接识别肿瘤细胞表面抗 原，并且在同时，激活T细胞并因此表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。 为了增强第一代CAR激活T细胞的能力的目的，已经开发出第二代CAR，其中将作 为T细胞的共刺激分子的CD28的胞内结构域与第一代CAR相连接。作为进一步改善的形 式，也已经开发出第三代CAR，其中将衍生自作为肿瘤坏死因子（TNF)受体超家族的⑶137 (4-1BB)或⑶134 (0X40)的胞内结构域串联连接到第一代CAR上。因此，已经报道了靶向 肿瘤抗原的许多CAR分子（非专利文献1)。然而，用作当前报道的第二代和第三代CAR的 胞内结构域的共刺激分子是有限的。已知当连接到CAR上时，衍生自T细胞的每种共刺激 分子的胞内结构域并不能一致地强烈刺激T细胞以破坏靶肿瘤细胞。例如，已经报道连接 有胞内结构域衍生自CD137的胞内结构域的第二代CAR表现出的细胞毒活性的程度仅与第 一代CAR相同，也就是说，该胞内结构域在改善CAR的功能中无效（非专利文献2)。因此， 需要找寻新的当连接CAR时是有效的共刺激分子。 作为在T细胞亚群即调节性T细胞上表达的基因而被发现的糖皮质激素诱导的肿 瘤坏死因子受体（GITR)是在细胞表面上的跨膜蛋白受体，并且是TNF受体超家族一个成 员（非专利文献3)。已经证明GITR组成型地存在于非活化的T细胞上。GITR结合到称为 GITR配体（以下称为GITRL)的另一跨膜蛋白上。已经证明GITR的激动性抗体消除调节性 T细胞的免疫抑制活性，这表明GITRL发挥经由GITR而控制调节性T细胞的活性的功能性 作用（参见非专利文献4)。 引用文献列表 非专利文献 非专利文献 1: Current Opinion in Immunology,第 21 卷，第 215-223 页（2009) 非专利文献2: J. Immunology,第 172卷，第 104-113页（2004) 非专利文献3: Immunol. Rev·,第 182卷，第 18-32页（2001) 非专利文献 4: Immunity,第 16卷，第 311-323 页（2002)。 专利技术概述 本专利技术要解决的问题 本专利技术的目的是提供编码CAR的核酸和表达CAR的细胞，所述CAR特异性结合到靶抗 原上并将针对靶细胞的高细胞毒活性赋予细胞。 解决问题的方法 本专利技术人集中地作出努力以解决上述问题，结果发现了表达具有GITR胞内结构域的 CAR的细胞特异性结合到靶抗原胞内结构域，并具有针对靶细胞的高细胞毒活性。因此，完 成了本专利技术。 本专利技术主要涉及以下方面。 编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构 域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括糖皮质激素诱导的肿瘤 坏死因子受体（GITR)的胞内结构域。 根据的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述抗原是肿瘤抗原。 根据的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述能够结合抗原的胞外结构域 是结合抗原的抗体的单链可变片段。 根据的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述胞内结构域进一步包括 CD3 4胞内结构域。 根据的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述GITR的胞内结构域配置在 ⑶3 ζ胞内结构域的C-末端侧。 嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞 内结构域，其中所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。 根据的嵌合抗原受体，其中所述抗原是肿瘤抗原。 根据的嵌合抗原受体，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原 的抗体的单链可变片段。 根据的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域进一步包括CD3 4胞内结构 域。 根据的嵌合抗原受体，其中所述GITR的胞内结构域配置在⑶3 ζ胞内结 构域的C-末端侧。 制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，所述方法包括将根据至中任一 项的核酸引入细胞的步骤。 根据的制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，其中所述细胞是Τ细胞或 含有Τ细胞的细胞群。 嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了根据至中任一项的核酸。 根据的嵌合抗原受体表达细胞，其中所述细胞是Τ细胞或含有Τ细胞 的细胞群。 专利技术效果 根据本专利技术，提供嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细 胞，它们可用于靶向抗原例如肿瘤抗原的过继免疫基因治疗领域。当将本专利技术的嵌合抗原 受体引入细胞时，所述嵌合抗原受体在细胞中的表达量高，并且所述细胞表现出高细胞毒 活性。 附图简述 图1显示制备用于各实施例的CAR的程序。抗CEA (癌胚抗原）单克隆抗体 的scFv显示为"CEA-scFv"，铰链区显示为"⑶8铰链"，⑶28跨膜结构域显示为"⑶28 TM"， ⑶28胞内结构域显示为"⑶28 I⑶（胞内结构域）"，⑶3 ζ胞内结构域显示为"⑶3 ζ"，末 端重复序列显示为"LTR"，剪接供体序列显示为"SD"，剪接受体序列显示为"SA"，包装信 号序列显示为"Ψ"。 图2显示用于各实施例的CAR的结构。结合抗原的抗体的scFv显示为 "scFv"，间隔结构域（spacer domain)显示为"间隔结构域"，CD28跨膜结构域显示为"CD28 TM"，CD28胞内结构域显示为"CD28 ICD"，GITR跨膜结构域显示为"GITR TM"，GITR胞内 结构域显示为"GITR I⑶"，⑶3 ζ胞内结构域显示为"⑶3 ζ"。在本说明书中，⑶R结构分 别缩写为⑴ z、（2) 28z、（3) z28、（4) Gz本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：珠玖洋，织户由贵，峰野纯一，冈本幸子，天石泰典，
申请(专利权)人：国立大学法人三重大学，宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP