一种双链siRNA分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种双链siRNA分子及其应用，更具体地，本发明专利技术针对大鼠垂体瘤细胞MMQ细胞中D2R基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入MMQ细胞后能明显促进催乳素的合成和分泌。

【技术实现步骤摘要】
一种双链siRNA分子及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种双链siRNA分子及其应用，更具体地，本专利技术针对大鼠垂体瘤细胞MMQ细胞中D2R基因的核苷酸序列设计合成siRNA，所述siRNA转入MMQ细胞后能明显促进催乳素的合成和分泌。
技术介绍
RNA干扰(siRNA)是机体内广泛存在的一种双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象[FireA.，etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature1998；391：806-811]，因其具有沉默效率高、特异性强以及操作简便等优于传统基因敲除手段的优点而得到迅速发展，现成为生命科学领域中重要的研究工具[ArzimanZ.，etal.E-RNAi：awebapplicationtodesignoptimizedRNAiconstructs.NucleicAcidsRes2005；33：W582-W588]。siRNA与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。该复合物能够结合到同源的mRNA上并诱导其降解。药源性高催乳素血症是临床常见的不良反应，发生率高达42％-66％[HalbreichU.，etal..Hyperprolactinemiaandschizophrenia：mechanismsandclinicalaspects.Journalofpsychiatricpractice2003；9：344-353]，短期内引起泌乳、闭经，长期会造成体重增加、骨质疏松及增加乳腺癌、子宫内膜癌的发病率，严重影响患者的身心健康及治疗的依从性。催乳素的调节是一个很复杂的系统，涉及多种神经递质、神经肽、代谢产物、机体的激素信号改变等。这些因素大体可以分为两类：催乳素释放因子(PRF)和催乳素抑制因子(PIF)[MadhusoodananS，.etal.Hyperprolactinemiaassociatedwithpsychotropics--areview.Humanpsychopharmacology2010；25：281-297]。多巴胺是最主要的催乳素抑制因子(PIF)，它通过垂体催乳素细胞膜上的多巴胺D2受体(D2R)，抑制催乳素的合成和释放[CooksonJ.，etal.Prolactin，hyperprolactinaemiaandantipsychotictreatment：areviewandlessonsfortreatmentofearlypsychosis.JPsychopharmacol2012；26：42-45]。MMQ细胞是一种来源于大鼠垂体瘤细胞的典型高催乳素血症细胞模型[JuddAM.，etal.CharacterizationoftheMMQcell，aprolactin-secretingclonalcelllinethatisresponsivetodopamine.Endocrinology1988；123：2341-2350]。MMQ细胞的细胞膜上含有多巴胺D2受体(D2R)，能够对多巴胺及多巴胺类药物反应。溴隐亭等多巴胺受体激动剂能够激动MMQ细胞上的D2R，抑制其胞内催乳素的分泌。临床中，甘草作为一种中草药，经常被用来治疗高催乳素血症。甘草苷是一种从甘草中提取的重要天然化合物，尽管现有文献已报道甘草苷具有治疗咳嗽、炎症、咽炎、抗心律失常、胃溃疡、肿瘤、脂肪肝、心肌缺血、脑血栓、脑缺氧等作用，还未见关于甘草苷治疗高催乳素血症的报道，但是甘草苷作为甘草中的活性成分，其作为候选药物在治疗高催乳素血症方面的疗效值得期待。为了研究候选药物对高催乳素血症的疗效及其作用机制，通常采用siRNA干扰的技术方案：利用针对D2R的siRNA，干扰D2R的功能，给研究对象施用候选药物，通过检测催乳素的合成和分泌情况，验证该候选药物是否具有治疗高催乳素血症的功效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种高效的针对D2R基因的广谱小分子干扰RNA(siRNA)。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种双链siRNA分子，根据本专利技术的实施例，该双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：siRNA：正义链：5’-caGCAGGATTCACTGTGACAT-3’(SEQIDNO：1)，反义链：5’-ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3’(SEQIDNO：2)；本专利技术提供了siRNA分子在制备降低细胞D2R基因表达试剂中的应用。本专利技术提供了siRNA分子在制备促进细胞催乳素分泌试剂中的应用。本专利技术提供了siRNA分子在制备促进细胞催乳素合成试剂中的应用。优选地，本专利技术使用的细胞是MMQ细胞。根据本专利技术的实施例，siRNA能明显降低D2R基因的表达水平。根据本专利技术的实施例，siRNA能明显缓解甘草苷介导的催乳素分泌的抑制。根据本专利技术的实施例，siRNA能明显缓解甘草苷介导的催乳素合成的抑制。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1显示了利用免疫印迹的方法检测siRNA对D2R基因的沉默效果；图2显示了siRNA对催乳素分泌的影响；图3显示了siRNA对催乳素表达的影响，其中：图3a显示了利用QPCR检测siRNA对催乳素基因转录水平的影响；图3b显示了利用免疫印迹检测siRNA对催乳素基因表达水平的影响。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例1siRNA对D2R基因沉默效果的检测实验1.1主要仪器：细胞培养箱(Thermo)。1.2主要材料和试剂：脂质体2000转染试剂(Invitrogen)，DMEM培养基(Gibco)。1.合成siRNA在Genebank中找到D2R的基因序列(GenBank-ID：NM_012547)。由上海吉凯基因公司设计及化学合成，共设计三对siRNA序列，2.0OD(5nmol)*2只，如下：siRNA1：正义链：5’-caGCAGGATTCACTGTGACAT-3’(SEQIDNO：1)，反义链：5’-ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3’(SEQIDNO：2)；siRNA2：正义链：5’-caGGATTCACTGTGACATCTT-3’，反义链：5’-AAGATGTCACAGTGAATCCTG-3’；siRNA3：正义链：：5’-aaCCTGTGTGCCATCAGCATT-3’，反义链：5’-AATGCTGATGGCACACAGGTT-3’；空的靶基因siRNA(siNT)正义链：5’-UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3’，反义链：5’-UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3’。2.沉默效率验证2.1细胞培养：MMQ细胞在含10％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养。2.2细胞铺板并转染：将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双链siRNA分子，其特征在于，所述双链siRNA分子由下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5’‑caGCAGGATTCACTGTGACAT‑3’(SEQ ID NO：1)，反义链：5’‑ATGTCACAGTGAATCCTGCTG‑3’(SEQ ID NO：2)。

【技术特征摘要】
1.一种双链siRNA分子在制备促进细胞催乳素蛋白分泌试剂中的应用，其特征在于，所述双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5’-caGCAGGATTCACTGTGACAT-3’，反义链：5’-ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3’。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传跃，徐志卿，张志洋，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京安定医院，
类型：发明
国别省市：北京;11