本发明专利技术公开了一种短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色方法，属于分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域。本发明专利技术包括如下步骤：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，再用去离子水进行漂洗，然后用花青素类核酸染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。本发明专利技术无需使用放射性同位素，简便易行，染色效果好，能够检出长度为5-11个碱基的短链寡核苷酸；标本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸即可进行分析；且检测灵敏度高，比直接花青素染色提高200倍以上。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色方法，属于分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域。本专利技术包括如下步骤：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，再用去离子水进行漂洗，然后用花青素类核酸染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。本专利技术无需使用放射性同位素，简便易行，染色效果好，能够检出长度为5-11个碱基的短链寡核苷酸；标本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸即可进行分析；且检测灵敏度高，比直接花青素染色提高200倍以上。【专利说明】
本专利技术涉及分子生物学核酸非放射性同位素染色方法领域，具体是在电泳后采用 甲醇固定，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和 SYBR Green II RNA gel stain 两种花青素类核酸染料中的一种进行染色，对长度为5-11个碱基的寡核苷酸进行检测的 方法。
技术介绍
寡核苷酸主要是指20个以下碱基的短链核苷酸，包括脱氧寡核糖核酸（DNA)及寡 核糖核酸（RNA)，在自然界中广泛存在，也可以是人工合成的产物，人工合成的寡核苷酸主 要用于PCR、核酸分子杂交、核酸连接反应和RNA干扰等过程。寡核苷酸质量的好坏可直接 影响上述过程的成败，因此在上述试验中常常需要检测寡核苷酸的长度和质量。目前检测 寡核苷酸长度和质量的简便有效的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳。 寡核苷酸经过聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，必须用放射性同位素标记或非放射性同 位素染色才能显现出来。由于放射性同位素标记可以进行原位放射自显影，短链寡核苷酸 扩散丢失较少，因此放射性同位素标记的优点是受检寡核苷酸的最小长度不受限制，其缺 点是可对操作人员造成损伤，对环境造成污染，放射废物不易处理等，现已几乎被非放射性 同位素染色所取代。 目前寡核苷酸的非同位素染色方法主要有溴乙锭（EB)染色、不对称花青素类染 色（包括SYBR Green I、SYBR Green II和SYBR Gold等）和银染色等。EB染色的最大优 点是价格便宜，操作简单，但EB是一种强致癌物质，易对环境造成污染或对操作人员造成 损害，且灵敏度不够高。不对称花青素的灵敏度比EB高，背景低，无需洗脱过程，未发现有 致癌性，在凝胶中检测DNA和RNA的灵敏度比EB高出10倍以上，可用于检测双链和单链 DNA以及RNA等，其主要缺点是成本较高，不够稳定，易受pH值等因素的影响。银染法的优 点主要是敏感度高，可接近甚至达到放射性同位素的水平，是目前检测寡核苷酸比较常用 的染色方法之一。 以上介绍的核酸染色方法对于15个碱基以上的长链寡核苷酸的检测都比较有 效。但除了银染法之外，上述其它染色方法都不能有效检测短链寡核苷酸，这是因为寡核苷 酸片段较短，尤其是当其长度只有11及11个碱基以下时，寡核苷酸在染色的过程中容易从 凝胶中扩散出来，从而造成染色失败。但采用银染法又有操作步骤较多，耗时较长，不能检 出某些寡核苷酸的缺点。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种比银染法更简便的短链 寡核苷酸非放射性同位素染色方法，用于检测5-11个碱基长度的短链寡核苷酸。 本专利技术采用的技术方案如下：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用 甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，防止或尽量减少其扩散，然后用去离子 水进行漂洗，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和 SYBR Green II RNA gel stain 两种花青素类染料中的一种染料进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。其 中 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 主要用于双链 DNA 染色，而 SYBR Green II RNA gel stain则主要用于RNA及单链DNA染色。 进一步地，上述对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为： (1)准备样品 将寡核苷酸配制成1〇〇μΜ的溶液，然后在微量紫外分光光度计上测定其 实际浓度；配制甲酰胺加样缓冲液，其配方为：96〇 μ 1甲酰胺，4〇μ 1 250mmol/L、 EDTA (ρΗ8· 0)，0· 05% (w/v)溴酚蓝； ⑵制作浓度为15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶：凝胶中丙烯酰胺与甲叉双 丙烯酰胺之重量比为19/1，尿素的浓度为4-7M，凝胶的大小为10X 10cm，厚度为0. 3_。凝 胶和电泳槽缓冲液分别为1XTBE和0. 5XTBE。 优选地，5-10个碱基的寡核苷酸选用30-45% (w/v)的凝胶，10-15个碱基的寡核 苷酸选用20-30% (w/v)的凝胶，15个碱基以上（含15个）的寡核苷酸选用15-25% (w/ v)的凝胶。 优选地，15-35% (w/v)凝胶中的尿素浓度为7M，40% (w/v)凝胶中的尿素浓度为 6M，45% (w/v)的凝胶中的尿素浓度为4M。 (3)变性处理：将1μ g的寡核苷酸与2μ 1加样缓冲液混勻，于95°C变性30-60秒， 迅速插入碎冰中，以破坏寡核苷酸的二级结构； (4)电泳：将上述已变性的寡核苷酸加样于15-45% (w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶 上进行电泳，电压为200-600V，电泳时间为1-4. 5小时，电泳温度为20-30°C。 进一步地，本专利技术用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上的具体步骤 为：将凝胶浸入甲醇固定液中，4-30°C浸泡1. 5-2小时，甲醇固定液为含有10% (v/v)乙酸 的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量为50ml/胶。通过甲醇固定液的固定，可以有 效防止短链寡核苷酸从染色剂中扩散出来，从而能使5-11个碱基长度的寡核苷酸被成功 检测。 凝胶被固定后，用去离子水（200ml/胶）漂洗3次，每次3分钟。 优选地，上述凝胶的浸泡温度根据寡核苷酸中碱基长度来确定，片段越短，浸泡温 度越低，以减少扩散。其中，8个及8个以上碱基长度的寡核苷酸的浸泡温度为15-30°C，8 个以下碱基长度可用选用4-15°C。 优选地，在电泳时，不同的凝胶浓度选用不同的电压：15%凝胶，为200V ;20%凝 胶，300V ;25%凝胶，400V ;30-35%凝胶，500V ;40-45%凝胶，600V。同时，电泳的时间也根 据凝胶的浓度来确定，15-25%的凝胶电泳时间为1小时；30%的凝胶电泳时间为1. 5小时； 35-40%的凝胶电泳时间为3-3. 5小时；45%的凝胶电泳时间为4. 5小时。 进一步地，本专利技术的方法中用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色是指将 2μ1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye加入10ml去离子水中，混勻后将凝胶充分浸 入其中，不留气泡，常温下浸泡30-60分钟。用SYBR Green II RNA gel stain染色是指将 Ιμ? 10000X的SYBR Green II RNA gel stain加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
短链寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于包括如下步骤：首先对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用甲醇固定液将寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝胶上，再用去离子水进行漂洗，然后用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain两种花青素类核酸染料中的一种进行染色，最后用紫外透视仪或凝胶成像仪观察结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李卫，张小龙，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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