改进的六胺银马松套染法制造技术

本发明专利技术涉及一种改进的六胺银马松套染法，包括以下步骤：配制银染试剂；将组织切片用Bouin液固定；切片依次浸入2.5%碘酒、5%硫代硫酸钠、1.5%高碘酸；取银染A液和银染B液浸染切片，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；3%硫代硫酸钠浸泡切片；苏木素浸染；盐酸酒精分化，水洗返蓝；丽春红染液浸染；1%磷钼酸浸泡切片；经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。本发明专利技术提供了一种试剂调配合理、染色效果好且时间短、性能稳定、套染色泽鲜艳的六胺银马松套染法，并在实验中取得了比现有方法更好的效果，改变了银染色中组织容易出现过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高及套染别的染色色彩不够鲜艳等问题。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，包括以下步骤：配制银染试剂；将组织切片用Bouin液固定；切片依次浸入2.5%碘酒、5%硫代硫酸钠、1.5%高碘酸；取银染A液和银染B液浸染切片，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；3%硫代硫酸钠浸泡切片；苏木素浸染；盐酸酒精分化，水洗返蓝；丽春红染液浸染；1%磷钼酸浸泡切片；经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。本专利技术提供了一种试剂调配合理、染色效果好且时间短、性能稳定、套染色泽鲜艳的六胺银马松套染法，并在实验中取得了比现有方法更好的效果，改变了银染色中组织容易出现过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高及套染别的染色色彩不够鲜艳等问题。【专利说明】
本专利技术涉及六胺银马松套染法，是肾组织穿刺活检的病理诊断必要的特殊染色方法之一。特别地，本专利技术涉及一种，可以用于显示肾组织中小球、小管、血管基底膜和组织免疫复合物沉积及纤维化等改变。
技术介绍
六胺银马松套染法是从霉菌染色的六胺银法演化形成的针对肾组织切片的染色方法，是六胺银和马松两种染色方法的叠加染色。在肾小球疾病中，常导致肾小球基底膜的改变，基底膜是一层高度含水性凝胶体的衬膜，主要由粘多糖和蛋白质构成，具有渗透性，常与纤细的结缔组织纤维密切结合。六胺银马松套染法是使肾组织经酸氧化后，基底膜内的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺银还原为黑褐色的金属银，从而使基底膜显示出黑色的着色。该法是肾穿刺活检病理诊断中是常规的特殊染色方法之一。它不仅能清晰显示肾组织中小球的数目，勾画出小球基底膜断裂、增生、折叠等形态改变，还能准确地显示免疫复合物在基底膜沉积位置，还能显示出肾小管萎缩状态、血管壁增厚与否及炎细胞浸润的严重程度等。因此，六胺银马松套染法对于肾脏病理临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据，是肾脏病理诊断必不可少且难度最大的特殊染色方法。目前，国内外的专业人士想尽了许多办法改进常用的基底膜银染色方法，包括Gomori法、Jonej s法、矢岛(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等,企图取得更好的基底膜染色质量，但是依然存在以下种种问题:银染色中组织容易出现过染；时间、温度较难控制；背景颜色过高；套染别的染色色彩不够鲜艳等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，该方法中的银染试剂调配合理、染色效果好、时间短、性能稳定、套染染色色泽鲜艳，能够更好地为肾脏病理临床诊断、分类和治疗提供重要的依据。本专利技术所述的一种，包括以下步骤:(I)配制银染试剂，包括:银染A液:蒸馏水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml ;银染B液:蒸馏水100ml, IOg硝酸银；5%硼砂:蒸懼水100ml, 5g硼砂；15%六次甲基四胺:蒸馏水100ml，15g六次甲基四胺；4%硼酸:蒸馏水100ml，4g硼酸；1.5%高碘酸:蒸馏水100ml, 1.5g高碘酸；丽春红染液:丽春红S0.7g，酸性品红0.3g，蒸馏水100ml，冰醋酸Iml ；1%苯胺蓝:苯胺蓝lg，冰醋酸1ml，蒸馏水IOOml ；1%磷钥酸:磷钥酸lg，蒸馏水IOOml ；(2)将组织切片用Bouin液固定，脱蜡，入水；(3)切片浸入2.5%碘酒3分钟，蒸馏水洗3次；(4)切片浸入5%硫代硫酸钠5分钟，蒸馏水洗3次；(5)切片浸入1.5%高碘酸15分钟，氧化温度在20_25°C之间，蒸馏水洗3次。(6)取银染A液30ml过滤并于70°C预热25分钟；(7)将银染B液0.82ml加入预热好的银染A液中，混匀放入切片，70°C浸染15分钟后每5分钟镜下观察基底膜的着色情况，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；蒸馏水洗3次；(8) 3%硫代硫酸钠浸泡切片15秒，水洗3分钟X 3次；(9 )苏木素浸染15分钟，水洗；( 10)盐酸酒精分化，水洗返蓝；(11)丽春红染液浸染12分钟，水洗I分钟X 3次；(12) 1%磷钥酸浸泡切片I分钟，直接入1%苯胺蓝浸染4分钟；(13)切片经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。根据本专利技术所述的六胺银马松套染法的进一步特征，所述的蒸馏水为电子级超纯水或双蒸分析实验室一级用水。本专利技术所述的，对于染液的试剂浓度比例关系、染色时间、染色温度及套染染液的配比、步骤进行了改良调整，摸索出一种试剂调配合理、染色效果好且时间短、性能稳定、套染色泽鲜艳的方法，并在实验中取得了比现有方法更好的效果，改变了银染色中组织容易出现过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高及套染别的染色色彩不够鲜艳等问题。染色过程中金属银的还原是关键步骤，往往决定着染色的成败。胺银染色试剂中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸银的配比适当，能防止产生过量的胺银黑颗粒污染组织而影响组织病变的观察。本专利技术是在不断的摸索中调配出来胺银染色试剂中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸银的最佳配比，较Gomori法、Jonej s法、矢岛(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等国内外常用的银染法减少了硝酸银的含量。染液中银离子的含量降低，减少了胺银颗粒污染组织的可能。但是染液中银离子减少使基底膜着色需要更长的时间，长时间的胺银反应容易使染液变浑浊并出现黑色的反光膜，氯化金调色时很难清除掉切片上黑色的反光膜，致使切片背景较脏，不利于染色结果的判断。因此，本专利技术在调整配比的同时，调整了染色的温度和染色的时间，使染液未形成浑浊和反光膜前，基底膜的染色就已经完成，不需常规银染中的氯化金调色去除多余的银染颗粒。这种配比减少了肾组织棕黑色的背景着色，更有助于后面的双重染色。在染色的过程中肾组织经酸氧化后，使基底膜内的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺银还原为黑褐色的金属银而使肾小球的基底膜着色的。组织氧化是染色成功的前提。氧化一定要充分才能使醛基暴露完全，若氧化不够完全，切片银着色较浅，影响结果判断。本专利技术在氧化的过程提高了高碘酸的含量，延长了高碘酸的反应时间，充分暴露了基底膜内的醛基，提高了染液的使用次数和有效期。在银染的过程中除了试剂的配方、反应的温度和时间以外，本专利技术使用的器皿应预先用浓硫酸浸泡并冲洗干净。染色过程中，染液不能接触金属物质(如镊子)等影响染色外在因素。关于配染液的水，本专利技术对比了实验室常用的几种配试剂的水，包括:单蒸水、双蒸水、通过水处理系统处理过的分析实验室一级用水和电子级超纯水。实验表明，使用电子级超纯水和分析实验室一级用水双蒸处理后配银染试剂背景最低，染色质量最好。银染液用合适的实验用水配制并按上述步骤、时间和温度操作可以有效的防止银染过染，时间、温度较难控制，背景颜色过高等难以解决的问题。在肾组织六胺银染色之后常常进行Masson双重染色，其目的是为了在同一张切片中显示肾小球内的免疫复合物的沉积的部位、形态和病变范围以及肾间质纤维化的程度等。由于常规的六胺银染色已将组织中许多嗜银位点染成黑色，这会导致套染马松三色时肾小球内免疫复合物显色颜色浅淡，基底膜、系膜、胶原纤维及胞质、红细胞颜色对比不鲜艳。本专利技术改变了经典马松染色的配方，将混合红染液换成了丽春红S与酸性品红的配比染液，从而去除了混合红中的亮绿。并且摸索出了合适的染色时间，提升组织中的红细胞、细胞质及免疫复合物的鲜艳程度并且提高了间质中蓝色胶原纤维的对比。【专利附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的六胺银马松套染法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制银染试剂，包括：银染A液：蒸馏水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml；银染B液：蒸馏水100ml，10g硝酸银；5%硼砂：蒸馏水100ml，5g硼砂；15%六次甲基四胺：蒸馏水100ml，15g六次甲基四胺；4%硼酸：蒸馏水100ml，4g硼酸；1.5%高碘酸：蒸馏水100ml，1.5g高碘酸；丽春红染液：丽春红S0.7g，酸性品红0.3g，蒸馏水100ml，冰醋酸1ml；1%苯胺蓝：苯胺蓝1g，冰醋酸1ml，蒸馏水100ml；1%磷钼酸：磷钼酸1g，蒸馏水100ml；（2）将组织切片用Bouin液固定，脱蜡，入水；（3）切片浸入2.5%碘酒3分钟，蒸馏水洗3次；（4）切片浸入5%硫代硫酸钠5分钟，蒸馏水洗3次；（5）切片浸入1.5%高碘酸15分钟，氧化温度在20‑25℃之间，蒸馏水洗3次；（6）取银染A液30ml过滤并于70℃预热25分钟；（7）将银染B液0.82ml加入预热好的银染A液中，混匀放入切片，70℃浸染15分钟后每5分钟镜下观察基底膜的着色情况，直至基底膜显示清晰的黑色后终止；蒸馏水洗3次；（8）3%硫代硫酸钠浸泡切片15秒，水洗3分钟×3次；（9）苏木素浸染15分钟，水洗；（10）盐酸酒精分化，水洗返蓝；（11）丽春红染液浸染12分钟，水洗1分钟×3次；（12）1%磷钼酸浸泡切片1分钟，直接入1%苯胺蓝浸染4分钟；（13）切片经梯度酒精脱水后入二甲苯透明，中性树胶封片。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周展眉，王国保，曹维，杨满球，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44