硫磺矿硫化叶菌中（+）γ-内酰胺酶的编码基因及应用，属于酶工程领域，还提供了该（+）γ-内酰胺酶在拆分消旋体γ-内酰胺中的应用。本发明专利技术所述的（+）γ-内酰胺酶是下述（a）蛋白：（a）由序列表中的SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质，其具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。在拆分消旋体γ-内酰胺从而获得光学纯（-）γ-内酰胺的应用中，该酶在高温下还具有很高的生物活性，获得的（-）γ-内酰胺的光学纯度达99%以上，转化率达到49%。
【技术实现步骤摘要】
硫磺矿硫化叶菌中(+) Y -内酰胺酶的编码基因及应用
本专利技术属于酶工程领域，涉及来源于硫磺矿硫化叶菌中第二种新的(+ ) Y -内酰胺酶的编码基因，及该(+) Y-内酰胺酶在拆分消旋体Y-内酰胺中的应用。
技术介绍
20世纪90年代国际上兴起了一项为人类造福的高新技术产业一手性药物，这是医药界的一次重大变革。(-)2-氮杂双环-[2，2，I]-庚烷-5-烯-3-酮(简称(-)Y -内酰胺)是合成抗艾滋病药物阿巴卡韦和抗流感药物帕拉米韦重要手性中间体。近几年，科学家利用酶的专一性，用微生物酶法高效性拆分消旋体Y -内酰胺，从而得到(_) Y -内酰胺。具有对环境友好，节约成本等优点。目前报道的能拆分消旋体Y -内酰胺的微生物有硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus P2)、氧化经微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)> 嗜酸丛毛菌(Comomonas acidovorans)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、突光假单胞菌(Pseudomonas f luorescens)、青枯假单胞菌(Pseudomonas f luorescens)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、嗜热泉生古细菌(Aeropyrum pernix)。由于野生菌生长缓慢，蛋白表达量低、不稳定等诸多缺陷，构建相应的基因工程菌并用于工业化生产备受青睐。但是只有硫磺矿硫化叶菌、嗜酸丛毛菌、大豆慢生根瘤菌及嗜热泉生古细菌找到了相应的编码基因并完成基因工程菌构建，纯化出了相应的(+ ) Y -内酰胺酶。本专利技术的创新之处在于从硫磺矿硫化叶菌中找到一种(+ ) Y内酰胺酶，此种(+ )Y-内酰胺酶的编码氨基酸与硫磺矿硫化叶菌中已发现的(+ ) Y-内酰胺酶完全不同。这是首次从同一种菌中发现不同类型却具有相同功能的(+ ) Y -内酰胺酶。本专利技术的目的是提供一种新的、高效的能拆分消旋体Y -内酰胺的(+ ) Y -内酰胺酶。本专利技术所提供的(+ ) Y-内酰胺酶，来源于硫磺矿硫化叶菌，是如下(a)的蛋白:(a)由序列表中序列SEQ ID No:1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；其中，序列表中的SEQ ID No:1是由318个氨基酸构成。上述(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围。它是具有以下核苷酸序列之一:Ca)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQ ID NO:1蛋白氨基酸序列对应的多核苷酸。其中，序列表中的SEQ ID N0:2由957个碱基组成，其编码序列为自5，端的ATG起始密码子到3，端的TAA终止密码子的完整开放阅读框。一种重组载体，其特征在于:其上述的编码基因包括的核苷酸序列，原核表达载体为 PET30 或者 pET28。—种表达宿主,其特征在于:含有上述的重组载体，一般表达宿主为大肠杆菌。所述的硫磺矿硫化叶菌中(+ ) Y -内酰胺酶的应用，为在拆分消旋体Y -内酰胺从而得到(-)Y-内酰胺的应用。所述应用为:将消旋体Y -内酰胺底物加入0.5M，pH7.4的磷酸缓冲液中，使消旋体Y -内酰胺底物浓度在0.005M-0.1M之间；然后向其中加入( + )Υ_内酰胺酶，在90°C转化5_24h,制得(-)Y-内酸胺。进一步，纯化(+ ) Y-内酰胺酶蛋白采用热处理去除杂蛋白从而得到纯的(+ )Y-内酰胺酶的。进一步，纯化的(+ ) Y -内酰胺酶在拆分Y -内酰胺的时加入Ni2+或Zn2+。本专利技术所述的(+ ) Y-内酰胺酶是按照下述方法构建的:硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)基因组DNA为中科院微生物所王建军研究员惠赠。以硫磺矿硫化叶菌基因组为模版，设计目的基因的引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增基因。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR情况，然后回收957bp的条带。回收产物用T4连接酶连接到T载体上并转入DH5 α中，涂布到涂有x-gal和IPTG的氨苄霉素平板上(蓝白斑筛选)，37°C培养过夜。之后以白斑为模版，进行菌落PCR，将克隆出条带的菌送去测序，测序结果正确的菌转接到LB培养基中，37°C培养过夜，提取该菌质粒，并用Hind III，Nde I酶于37°C酶切该质粒以及PET30载体。1%的琼脂糖电泳检测酶切情况并分别回收酶切成功的目的基因及PET30载体。回收后的产物在T4连接酶作用下进行连接，再次转化到DH5a中，并涂布到含卡那霉素的平板上，进行菌落PCR。将克隆出条带的对应菌再次送去测序，测序结果正确后提取质粒，将质粒转入BL-21 (DE3)表达感受态中，用终浓度为2.5g/L的乳糖诱导表达出目的蛋白。本专利技术所述的(+ ) Y-内酰胺酶还可以通过化学合成其编码基因，通过常规基因操作手段将此化学合成的基因构建到表达载体，并导入大肠杆菌宿主细胞中得到转化子，培养该转化子，表达得到(+ ) Y-内酰胺酶。用于构建含有上述(+ ) Y-内酰胺酶编码基因的重组表达载体可以为基因工程菌领域中的表达载体，其载体包括PET系列载体，pUC系列载体等。选择的宿主细胞是与上述载体对应的宿主，一般优先选择大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS、E.coli JM109、E.coli HBlOUE.coli DH5 a等)。表达后的蛋白以已知的纯化方法进行纯化。本专利技术所述(+ ) Y -内酰胺酶可以用来拆分消旋体Y -内酰胺，并得到99%以上的光学纯(-)Y-内酰胺。由于该蛋白耐热性好，在100°C下还能保持很高的活性，因此本实验为了提高酶的反应效率，用高温煮蛋白来除去杂蛋白，并通过超滤管millipore对纯化后的蛋白进行浓缩。对于本专利技术所述的(+ ) Y-内酰胺酶的酶学性质，主要从最适温度，最适pH，温度稳定性，金属离子对酶活的影响等几个方面进行考察。本专利技术的意义主要在于:在同一种菌中发现了另一种(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因，并且此基因表达的(+ ) Y-内酰胺酶耐热性很高，对消旋体Y-内酰胺的拆分活性ee值达到99%以上。下面将结合附图对本专利技术的具体实施方法做进一步说明。【附图说明】 图1以硫磺矿硫化叶菌基因组为模版扩增目的片段的核酸电泳图，泳道I，PCR产物；泳道M，DNA标准分子量图2重组菌表达前后对比及纯化后蛋白SDS-PAGE图，泳道1，重组菌诱导前；泳道2，重组菌诱导表达后，泳道3，重组菌的纯化；泳道M，蛋白分子量标准；图3重组菌拆分消旋体Y -内酰胺HPLC图谱。A没有经过酶拆分的消旋体Y -内酰胺的HPLC分析图；B经过(+ ) Y -内酰胺酶拆分后获得(_) Y -内酰胺HPLC图谱；其中，I一乙酸乙酯，2 —( + ) Y -内酰胺，3 —Y -内酰胺。图4 ( + ) Y-内酰胺酶学性质的表征a: ( + ) Y -内酸胺酶最适温度；b: ( + ) Y -内酸胺酶最适pH ；c:( + ) Y-内酰胺酶的热稳定性；d:金属离子对(+ ) Y -内酰胺酶活性影响。【具体实施方式】 以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。实施例1本专利技术的(+ ) Y-内酰胺酶基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
硫磺矿硫化叶菌中（+）γ‑内酰胺酶，表达的蛋白质如下：（a）由序列表中的SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.硫磺矿硫化叶菌中(+) Y -内酰胺酶，表达的蛋白质如下: Ca)由序列表中的SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。2.一种包含权利要求1所述的(+ ) Y-内酰胺酶的编码基因，其特征在于:这种(+ )Y-内酰胺酶的编码基因具有下列核苷酸序列之一: Ca)序列表中SEQ ID No:2所示的核苷酸序列； (b)编码序列表中SEQ ID No:1的氨基酸残基序列对应的多核苷酸序列。3.—种重组载体，其特征在于:其含有权利要求2所示的编码基因包括的核苷酸序列，原核表达载体为PET30或者pET28。4.一种表达宿主,其特征在于:含有权利要求3所不的重组载体,一般表达宿主为大肠杆菌。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑国钧，黄蓉，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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