一种基于Taq酶末端转移酶活性构建T载体的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，具体为一种基于TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性构建T载体的方法。主要利用TaqDNA聚合酶末端转移酶活性在线性化平末端出发载体的3′-端添加T，然后利用T4DNA连接酶去除3′-端未加T载体自身环化背景，获得3′-端具有单个T突出的线性T载体。本发明专利技术获得的T载体质量稳定，自身环化背景低，克隆效果好，不但适用于小规模制备，也适用于大规模生产，将在基因工程领域发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Taq酶末端转移酶活性构建T载体的方法
本专利技术涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，具体为一种基于TaqDNA聚合酶末端转移酶活性构建T载体的方法。
技术介绍
T载体是一种方便的克隆PCR产物的线性载体，T-A克隆技术被证明对PCR产物的克隆极具价值。此方法的原理是利用TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性的末端转移酶活性，可将PCR双链产物的每一条链的3′-端加入一个突出的dA碱基，而线性T载体的3′-端正好含有与之互补配对的突出dT碱基，从而实现T-A互补连接。目前，经典的T载体构建方法有2种。第一种是先将质粒通过EcoRV或SamI等切口平末端的限制性内切酶线性化，然后利用末端转移酶或者具有末端转移酶活性的TaqDNA聚合酶在dTTP或ddTTP环境中给质粒平末端3′-端添加T。第二种方法是利用限制性内切酶酶切的方法，即在T载体前体中引入2个串联的能产生3′-端突出单碱基末端的限制性内切酶如XcmI或AhdI等识别位点，使用这些酶切割特异性序列后产生的末端为3′-端突出单碱基N（N代表任意碱基），如果将该碱基设计为T，则可以通过酶切T载体前体使其产生2个3′-端突出T碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于TaqDNA聚合酶末端转移酶活性构建T载体的方法，其特征在于：所述方法的步骤包括：步骤1．利用平末端内切酶酶切出发载体，回收获得线性化平末端载体；步骤2．利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性，在二价金属阳离子的作用下给线性化平末端载体加T，回收获得中间T载体；步骤3．利用T4 DNA连接酶连接步骤2所得中间T载体，去除3′‑端未加T载体，回收获得T载体。

【技术特征摘要】
1.一种基于TaqDNA聚合酶末端转移酶活性构建T载体的方法，其特征在于：所述方法的步骤包括：1）利用平末端内切酶酶切出发载体，回收获得线性化平末端载体；2）利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性，在二价金属阳离子的作用下给线性化平末端载体加T，回收获得中间T载体；3）利用T4DNA连接酶连接步骤2）所得中间T载体，去除3′-端未加...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕新，李玥仁，陈丽华，刘兰英，李巍，
申请(专利权)人：福建省农业科学院中心实验室，
类型：发明
国别省市：福建;35