一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白聚合能力的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的方法，该方法包括将纯化的重组人α-突触核蛋白与血浆在一定温度下振荡孵育使其聚合成寡聚体，用ELISA方法测定α-突触核蛋白寡聚体含量，通过寡聚体占总α-突触核蛋白含量的比率计算获得α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及一种检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的方法，该方法可用于帕金森病的诊断。
技术介绍
:帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止振颤、运动迟缓、肌肉僵直和姿势不稳定等运动症状[1’2]。引起这些症状的原因是中脑黑质多巴胺神经元大量死亡和由此引起的纹状体部位的多巴胺神经递质的大幅度减少。帕金森病的主要病理特征是神经细胞内出现嗜酸性包涵体一路易体(Lewy body)和路易神经索(Lewy neurite)。构成路易体和路易神经索的主要成分是纤维化的α-突触核蛋白(α-synuclein) [3]。大量研究表明，a -突触核蛋白是在帕金森病的发病中起关键作用的蛋白质。a-突触核蛋白基因点突变和多倍体变异可以引起家族性早发性帕金森病，其基因启动子多态性与帕金森病的发病风险有关[4_6]。已经证明，帕金森病人脑组织中的α-突触核蛋白存在改变，表现为该蛋白的表达量异常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修饰体增加[7_9]。这些异常表达和修饰的α-突触核蛋白是引起该蛋白聚集成寡聚体的原因并进而形成纤维而沉积在路易体中。大量证据表明，异常表达、修饰和聚集的α-突触核蛋白对神经元具有毒性作用，是各种原因导致神经元退变和帕金森病的关键[1°_13]。通过对帕金森病人组织的病理检查证明，路易体在病人的组织中广泛分布，除中枢神经系统的广泛区域外，还包括分布于各外周器官的神经组织，如消化道、膀胱、心脏、唾液腺等，并且认为消化道的路易体病变甚至早于中枢神经系统[14]。这些结果提示，帕金森病很可能是机体内环境改变引起的一种全身性代谢性紊乱疾病，血液作为机体内环境的重要组成部分，很可能发生某种改变，从而有利于α-突触核蛋白的聚集。这可能是以聚集的α-突触核蛋白为主要成分的路易体的广泛存在的重要原因。因此，检测血浆促进α-突触核蛋白形成能力或α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率有助于了解α-突触核蛋白在帕金森病人神经组织易于聚集的机体内在环境因素的改变。现有技术中对血液中α-突触核蛋白及其寡聚体的检测主要是对其含量的直接测定。所使用的方法主要是利用ELISA方法直接检测血浆或血清中α-突触核蛋白及寡聚体含量，尚未有关于检测血浆中a -突触核蛋白寡聚体形成率的文献报导。上述方法存在以下缺陷:对血浆和血清中的a -突触核蛋白及其寡聚体含量的测定结果极其不稳定，不同文献报道的正常值相差近1000倍，对病人血浆中的α-突触核蛋白及其寡聚体含量测定未能得出一致结论。例如，Foulds PG等人的一项研究检测到帕金森病人血浆中α-突触核蛋白含量较正常对照升高[15]，而Li QX等人的研究则发现帕金森病人血浆中a -突触核蛋白含量低于正常对照[16]。El-Agnaf等人的研究发现血浆中α-突触核蛋白寡聚体高于正常对照[17]，而Foulds PG等人的一项研究检测到帕金森病人血浆中α-突触核蛋白寡聚体含量低于正常对照[18]。这样相互矛盾的结果可能是由于血浆中α -突触核蛋白及其寡聚体本身含量较低，不同实验室所建立的ELISA方法的灵敏度之间存在差异以及样本溶血所造成的。因此，二者(上述方法)是否可作为帕金森病诊断标记物尚需进一步验证。为克服上述缺陷，本专利技术提供一种检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的检测方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，可以显著区分帕金森病人和正常健康人的血浆促进α -突触核蛋白寡聚体的形成能力，是筛选帕金森病高危人群和临床诊断帕金森病的重要手段。
技术实现思路
:本专利技术提供一种检测α -突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的检测方法，该方法可以用于测试血浆促进α-突触核蛋白寡聚体的形成能力。本专利技术将纯化的重组人α -突触核蛋白与血浆(人或动物)在一定温度下进行振荡孵育，使其聚合，然后利用识别人α-突触核蛋白同一抗原表位的单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测α-突触核蛋白在病人和正常健康人血浆中的寡聚体含量，并计算α -突触核蛋白寡聚体的形成率。本专利技术的寡聚体形成率的检测方法包括以下步骤和内容:I)分离血浆；2)加入重组人α -突触核蛋白，得到寡聚体；3)抗人α-突触核蛋白单克隆抗体和寡聚体反应，随后加入碱性磷酸酶和显色齐U，进行显色；4)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，根据标准曲线计算样品中寡聚体的形成率。以下对本专利技术所用名称术语进行解释:重组人α -突触核蛋白:将携带人α -突触核蛋白基因的质粒转染至大肠杆菌，培养、提取并纯化获得的帕金森病相关蛋白。血浆中人α -突触核蛋白寡聚体:血浆中存在的聚合形式的α -突触核蛋白，是其主要毒性形式。抗人α -突触核蛋白单克隆抗体:本专利技术的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体命名为1Β2抗体，用于识别α-突触核蛋白的特异氨基酸序列的鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体，可与灵长类动物的α-突触核蛋白发生反应。碱性磷酸酶:在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酹(ρΝΡ),其在λ=405nm处有最大吸收。亲和素标记的碱性磷酸酶:将碱性磷酸酶进行亲和素标记，亲和素可与生物素结合，起级联放大作用。显色剂:硝基苯磷酸单钠盐，可简称为pNPP单钠。与pNPP —样，用于ELISA的化学显色底物。碱性磷酸酶和PNPP反应后，形成黄色水溶反应产物，该产物在405nm处有光吸光。ELISA 酶标板:在酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked ImmunosorbantAssay, ELISA)中，作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起重要作用。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附，通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。PBS:憐酸缓冲液(phosphate buffered saline),浓度为 0.01mol/L。NaHCO3缓冲液:碳酸氢钠缓冲液,浓度为200mmol/L，pH9.6。封闭液:明胶含量为2.5%的PBST溶液，作用为封闭非特异结合，降低ELISA背旦-5^ OPBST:在0.01mol/L PBS中含有0.05% Tween-20即为磷酸盐吐温缓冲液，PBST。 标准曲线的制作方法如下:每次试验时将α-突触核蛋白进行系列稀释，终浓度分别为0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125、0 μ mol/L，与样品同时进行检测，读取相对应405nm处吸光值，做出其与浓度之间的关系曲线。本专利技术所述抗人α-突触核蛋白单克隆抗体属于全新的概念，为此，本专利技术还提供抗人α-突触核蛋白单克隆抗体作为本专利技术的一部分。本专利技术提供抗体抗人α-突触核蛋白单克隆抗体，其制备方法如下:步骤1，重组蛋白抗原的制备:制备并纯化人全长α -突触核蛋白作为抗原。步骤2，免疫小鼠:使用福氏完全佐剂(第一次免疫)与福氏不完全佐剂(随后的免疫)乳化重组人α-突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫(50 μ g抗原/次/小鼠)。抽取动物血清，利用E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测α‑突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂：重组人α‑突触核蛋白，抗人α‑突触核蛋白单克隆抗体1B2。

【技术特征摘要】
1.一种检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂:重组人α-突触核蛋白，抗人α -突触核蛋白单克隆抗体1Β2。2.根据权利要求1所述的试剂盒，试剂盒中还包括生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1Β2。3.根据权利要求1所述的试剂盒，根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂: 碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶 对硝基酚磷酸显色液 ELISA酶标板 磷酸盐缓冲液 NaHCO3缓冲液 封闭液 PBST。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中 磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L, NaHCO3 缓冲 液的浓度为 200mmol/L，pH9.6， 封闭液的浓度为2.5%，PBST 为含 0.05% Tween-20 的 0.01M PBS。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中各试剂分别包装，每个包装装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。6.抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2，其制备方法如下: 步骤1，重组蛋白抗原的制备:制备并纯化人全长α-突触核蛋白作为抗原， 步骤2，免疫小鼠:使用福氏完全佐剂进行第一次免疫，用福氏不完全佐剂进行随后的免疫，乳化重组人α -突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫，50 μ g抗原/次/小鼠，抽取动物血清，利用ELISA与Western blot方法检测其效价与特异性， 步骤3，筛选杂交瘤细胞株:选取血清效价高的小鼠，取出其脾细胞，在存在聚乙二醇4000的条件下与小鼠骨髓瘤细胞Sp2融合，随后使用HAT培养基对融合的产生抗体的杂交瘤细胞进行选择培养，最后用ELISA方法筛选可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞，ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞进一步利用免疫组化与免疫印迹法鉴定所筛选杂交瘤细胞产生抗体的特异性，经筛选，克隆号为1B2的杂交瘤细胞可以产生特异性抗人α-突触核蛋白抗体，1Β2的杂交瘤细胞经过2次亚克隆进行纯化后，在冷冻保护液的保护下与液氮中长期保存，步骤4 ;抗体制备:将1Β2杂交瘤细胞从液氮中复苏，并用杂交瘤培养基在培养箱中大量扩增，收获细胞，将细胞由腹膜内注射入BALB/c裸鼠体内，产生腹水，收获腹水，利用protein A亲和层析纯化法获得纯化的1B2鼠抗人α -突触核蛋白单克隆抗体，定量、分装、保存。7.生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1Β2，其制备方法如下: 步骤1，用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，步骤2，用0.lmol/L, pH8.8硼酸盐缓冲液配制浓度为I~3mg/ml的抗体1B2溶液，若抗体1B2储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠，步骤3，按25~100 μ g/mg的比率将生物素酯加入抗体1B2中，混合均匀并在室温下孵育4h， 步骤4，每250 μ g生物素酯内加入20 μ I lmol/L的氯化铵，室温孵育lOmin， 步骤5，将抗体1B2溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素， 步骤6，按纯化抗体的储存方法保...

【专利技术属性】
技术研发人员：于顺，尹娜，杨巍巍，李昕，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：北京;11