一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，利用蛋白质相转变方法，将溶菌酶固定到无污染表面，在此基础上，再利用生物分子间的特异性结合原理，进一步固定目标生物分子，实现生物分子的特异性捕获，然后，通过胍溶液清洗基材表面，清洗后的基材表面不仅仍保持着最初的抗污染性能，还能进一步的吸附溶菌酶相转变产物，实现了在生物惰性和生物活性基材之间近100％的可逆转变。本发明专利技术操作简单，可直接从血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等中高灵敏度检测目标生物分子，且可实现基材的重复利用，降低了成本，实现了绿色化学。

【技术实现步骤摘要】
—种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法
本专利技术属于生物分子的检测
，具体涉及一种通过生物活性基材和生物惰性基材之间的可逆转变实现生物分子的低成本、高灵敏度检测的方法。
技术介绍
在惰性无机或有机材料表面固定生物分子对于生物医用材料来说具有重要意义。固定细胞、蛋白质、酶甚至DNA片段的生物载体被广泛用于细胞培养基、医用支架、蛋白质芯片、生物传感器和基因芯片之中。而固定了生物分子的基材，在实现目标分析检测之后的循环多次利用，可有效降低成本，实现绿色化学。首先在基材制备方面，固定生物分子的方法之一就是对表面进行改性，在表面上产生官能团，实现表面功能化。传统的芯片制备工艺，由于惰性基材表面化学结构仅有有限的反应效率，需要对固相载体表面进行特殊、复杂的物理/化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析。很少有人报道条件温和、环境友好且高效的制备方法。如罗伯特.S.马特森等发现了一种制备用于排列生物分子或细胞的基底的方法，方法包括如下步骤:(a)提供带有表面的固体载体；及(b)通过化学等离子体介导的聚合方法在所述表面上沉积聚合涂层，其中所述聚合涂层包括至少一个侧官能团，其能结合所述生物分子或细胞。可见，上述方法需要对基材表面进行复杂的物理/化学处理，这就不利于保持基材本身性质的完整性。其次，在各种生物应用领域，迫切需要生物分子的可逆结合/释放体系。这样的转变将会有效地引导一个理想的进程，即促进在线净化和低浓度生物分子的富集及进一步检测。此外，智能型的捕获/释放生物分子在诸多其他高科技领域如生物医药、组织工程和信息反馈等也有广泛应用。实际的生物医学方法需要利用生物分子/细胞捕获/释放的可逆体系，这种可逆转变，先分离目标生物分子/细胞，从生物体液中固定并集中到表面，最后将其释放，以便作随后的光谱/荧光检测和细胞膜片/生物膜分离。尽管很多方法是合理且可取的，但要实现捕获和释放完全可逆很具挑战性，因为在传统的智能基材表面上广泛存在非特异性吸附，不易除去非特异性吸附、不能达到生物活性和生物惰性100%的可逆转变。因此，相关设备的优良性能受到了限制。故探索一种新的体系来实现生物分子的可逆捕获/释放，具有重要意义。再次，为实现绿色化学，充分利用资源和能源，降低成本，除了采用无毒、无害的原料外，还应该减少废物向环境排放；这就提出了一个新问题，即如何实现抗污染基材的重复再利用。它要求二次利用的无污染表面，不仅保持着其原始的抗污染性能，还能进一步在温和条件下固定生物分子，实现基材的多次循环利用。要完全将生物活性表面去活化成惰性表面，由于低的化学反应产率和速度受到了极大的限制，因此不能实现近100%的完全转变。因此要实现生物活性基材表面到生物惰性基材表面的有效转换，同样具有挑战性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有生物分子检测方法中，抗污染基材必须经过复杂、苛刻的物理/化学处理，且检测后的基材无法重复使用的缺点，提供一种成本低廉，抗污染基材处理条件温和，处理后的基材能够特异性捕获目标生物分子，且检测后的基材可重复利用的高灵敏度检测生物分子的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成:1、制备生物活性基材以lOmmol/L pH值为7.4的4_羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为I?5mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养I?4小时，然后依次用lOmmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材。2、检测目标生物分子以lOmmol/L pH值为7.4的4_羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，配制质量-体积浓度为0.01?lmg/mL的链霉亲和素溶液，然后将其铺展到步骤I制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养I?4小时,然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-轻乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，在基材表面固定生物素标记的目标生物分子的抗体或抗原，用此抗体或抗原检测待测样品中的目标生物分子。3、基材重复利用将步骤2中检测完后的基材在3?6mol/L的胍水溶液浸泡I?2分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，按照步骤I的方法重新制备成生物活性基材，重复使用。上述的制备生物活性基材步骤I中，优选以10mmol/L pH值为7.4的4_羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为2mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，然后依次用lOmmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材。上述的检测目标生物分子步骤2中，所述的链霉亲和素溶液的质量-体积浓度优选 0.1 ?0.5mg/mL。上述的基材重复利用步骤3中，所述的胍水溶液的浓度优选3mol/L。本专利技术的有益效果是:1、本专利技术不对抗污染背景做任何活化和钝化处理，直接采用简易温和且环境友好的方法快速将生物分子固定在抗污染基材表面，操作简单，制备效率高，且所用原料无毒、来源广泛。2、本专利技术可直接从血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等中高灵敏度检测目标生物分子，如肿瘤标志物、癌细胞，且检测完后的基材经胍溶液清洗即可实现在生物惰性和生物活性基材之间近100%的可逆转变，实现了基材的循环多次利用，降低了成本，收集的洗液还可以作后续的光谱/荧光检测和细胞膜片/生物膜分离。【附图说明】图1是检测血清中不同浓度甲胎蛋白的荧光照片。图2是检测缓冲液中不同浓度绿色荧光蛋白的荧光照片。图3是检测缓冲液和血清中不同浓度菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素的荧光光谱图。图4是不同基材的浊度柱状图。图5是实施例1中重新制备的生物活性基材固定异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素的荧光照片。图6是图5中的基材经胍溶液清洗后的荧光照片。图7是图6中的基材固定异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素的荧光照片。【具体实施方式】下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例11、制备生物活性基材将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯加入甲醇与蒸馏水的体积比为1:1的混合液中，配制成质量-体积浓度为0.01g/mL聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯溶液，然后将其旋涂在干净的玻璃表面，自然条件下晾干，得到抗污染基材。以lOmmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为2mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到得到的抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)制备生物活性基材以10mmol/L pH值为7.4的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2‑羧乙基)膦溶液和质量‑体积浓度为1～5mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材；(2)检测目标生物分子以10mmol/L pH值为7.4的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，配制质量‑体积浓度为0.01～1mg/mL的链霉亲和素溶液，然后将其铺展到步骤(1)制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，在基材表面固定生物素标记的目标生物分子的抗体或抗原，用此抗体或抗原检测待测样品中的目标生物分子；(3)基材重复利用将步骤(2)中检测完后的基材在3～6mol/L的胍水溶液浸泡1～2分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，按照步骤(1)的方法重新制备成生物活性基材，重复使用。...

【技术特征摘要】
1.一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于它由下述步骤组成: (1)制备生物活性基材 以10mmol/L pH值为7.4的4-轻乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂,分别配制50mmol/LpH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为I?5mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养I?4小时,然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材； (2)检测目标生物分子 以lOmmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，配制质量_体积浓度为0.01?lmg/mL的链霉亲和素溶液，然后将其铺展到步骤(I)制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养I?4小时,然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-轻乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，在基材表面固定生物素标记的目标生物分子的抗体或抗原，用此抗体或抗原检测待测样品中的目标生物分子； (3)基材重复利用 将步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏，吴正芳，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61