一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术技术方案

本发明专利技术公开一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)方法，该方法通过将筛选靶标固定于固相载体聚苯乙烯微量反应板中，将下游端标记过生物素的单链核苷酸库与之相结合，经过温育反应冲洗之后，加入链霉素亲和素-荧光物质鉴定本轮筛选的效果，用特定的洗脱液将已结合的ssDNA洗脱并扩增，用于下一轮筛选，直到最终筛选出能特异结合靶标的核酸适配体。本发明专利技术可有效克服常规SELEX方法不能实时检测筛选效果的弊端，也无需毛细管电泳等昂贵设备，可广泛用于针对各种靶标的核酸适配体快速筛选。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)方法，该方法通过将筛选靶标固定于固相载体聚苯乙烯微量反应板中，将下游端标记过生物素的单链核苷酸库与之相结合，经过温育反应冲洗之后，加入链霉素亲和素-荧光物质鉴定本轮筛选的效果，用特定的洗脱液将已结合的ssDNA洗脱并扩增，用于下一轮筛选，直到最终筛选出能特异结合靶标的核酸适配体。本专利技术可有效克服常规SELEX方法不能实时检测筛选效果的弊端，也无需毛细管电泳等昂贵设备，可广泛用于针对各种靶标的核酸适配体快速筛选。【专利说明】一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术
本专利技术涉及一种改进的指数富集的配体系统进化技术，主要改进其筛选过程的实时监测和筛选靶标的固相化方法，主要用于高特异性核酸适配体的快速筛选。
技术介绍
指数富集的配体系统进化技术(SELEX)是指寡核苷酸依靠自身对相应靶物质的高亲和力和高特异性，在一含有极多随机序列的寡核苷酸文库中，通过多次的选择富集，来获取所需要的特定结构和功能适配子的过程。这一技术适用于富集任何特殊需要的生命小分子物质。SELEX技术的发展基于上世纪70年代和80年代的单克隆、核酶、PCR技术。目前这一技术已经广泛应用于基因调控与信号传导、蛋白质功能、核酸、肿瘤学、病毒学及食品安全检测等众多领域。但目前SELEX方法仍存在筛选过程较长，因为特定核苷酸在文库中的含量较低，前期筛选存在盲筛，最终筛选成功率较低等弊端；而且目前筛选仍要借助的毛细管电流等昂贵仪器设备，限制了这一技术的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题:克服现有技术的缺陷，提供一种快速、可实时监测、不依赖昂贵设备的SELEX方法。本专利技术的技术方案: 构建长度为60-100 nt的随机ssDNA文库,两端为固定序列，中间20-60个核苷酸为随机序列，库容量至少为1014。设计随机ssDNA文库:5’ - CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(20-60 nt) -AGTATCGCT AATCAGGCGGAT -3，。上游引物设计:5’-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3’，下游 5’ 端标记生物素:5’ -生物素-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-3 ’。以ssDNA文库为模板，进行PCR扩增得到3’端带有生物素的dsDNA文库，经生物素-链霉素磁珠分离ssDNA。将分离的文库与固相结合于聚苯乙烯微量反应板的靶标在适当温度条件下反应，反应一定时间后，用冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA ;加入适量链霉素-突光素,在酶标仪中检测其荧光强度，初步判定筛选效率；在PCR体系中，下游引物的5’端标记有生物素。加洗脱缓冲液于80°C作用lOmin，经酚-氯仿抽提、乙醇溶液，将ssDNA溶解于20 μ I TE缓冲液中，将ssDNA用标记生物素的引物经PCR扩增成一端带生物素的dsDNA。经生物素-链霉素磁珠分离ssDNA，用于下一轮筛选的ssDNA文库。本专利技术的积极有益效果: 1.本专利技术的S ELEX方法具有下列优点: (1)可实时监测:利用链霉素偶联荧光物质的高灵敏性，可在筛选前期对初步筛选效果进行判定，以最大限度加快SELEX筛选进程；(2)设备简单:固相SELEX方法仅需要可检测荧光的酶标仪，可大大减少对毛细管电泳等大型设备的依赖，推动SELEX方法的普及应用。2.本专利技术的检测方法可广泛用于靶标的核酸适配体筛选，具体包括:酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等；也包括有机染料、金属离子、药物、氨基酸等小分子物质的筛选。【专利附图】【附图说明】图1:本专利技术的可实时监测的固相SELEX方法示意图。图2:本专利技术用于重金属筛选核酸适配体的过程示意图。【具体实施方式】本专利技术的检测方法可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，具体包括:酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等；也包括有机染料、金属离子、药物、氨基酸等小分子物质的检测。实例1: 以重金属铅的核酸适配体筛选过程进行举例说明。(I)铅离子及 载体蛋白与DTPA的偶联 本实验主要通过异硫氰酸酷法和戊二醛法将金属离子通过双功能金属鳌合剂DTPA与载体蛋白偶联获得相应的偶联物。异硫氰酷法:分别称取BSA IOmg溶于0.5ml HEPES缓冲液(IOmM Hepes, pH 9.0),9.0 mg P-NH2-Bn-DTPA 溶于 200 μ L 的水中，称 8mgPb (NO3) 2 溶于 200 μ L 2%ΗΝ02 中。200 μ I p-SCN-Bn-DTPA溶液在搅拌下滴加到0.5 mL蛋白溶液中，随后加入100μ L三乙丁胺(1.5 Μ)，室温反应24h，用处理过Centricon-30超滤除去未反应的小分子。先用HEPES缓冲液(10 mM, pH9.0)洗三次，再用HBS(10mM，pH7.4)洗两次。纯化的BSA-Bn-DTPA中加入200 μ LPb (No3) 2溶液室温反应4h，用上述同样的方法超滤除去未反应的金属离子。所得终产物即为Pb-CN-Bn-DTPA。称取30 mg 牛血清白蛋白(BSA)溶于 6 mLHBS (10 mM Hepes, 137mM NaCl, 3mMKCI，pH7.4)，称取18mg金属鳌合剂Pb-NH2-Bn-DTPA溶于1.8 mL超纯水中。将6mL BSA逐滴滴加到1.8mL金属鳌合剂，然后加入1.8 mL的20 mM戊二醛，室温下轻轻搅拌24h，纯化除去其中未反应的小分子物质(金属鳌合剂)。反应物产物BSA-DTPA均分成两份，一份加Λ 14.6 μ L Pb (Ν03) 2 (424.25mM)，室温反应 4h,经纯化获得 Pb-NH2-Bn-DTPA_BSA。同上原理和步骤制备NH2-Bn-DTPA-BSA。(2)随机ssDNA文库的构建、引物合成及扩增条件的优化 构建长度为60-100 nt的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间20-60个核苷酸为随机序列，库容量至少为1014。设计随机ssDNA文库:5’ -CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT - (20-60 nt) -AGTATCGCTAATCAGGCGGAT -3，。上游引物设计:5’ -CCCCTGCA GGTGATTTTGCTCAAGT-3’，下游 5’ 端标记生物素我:5’ -biotin-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-3 ’。随机ssDNA文库和引物均由生物合成公司合成。通过合成的引物，优化文库PCR扩增条件。在PCR体系中，下游引物的5’端标记有生物素。以ssDNA文库为模板，进行PCR扩增得到3’端带有生物素的dsDNA文库。dsDNA文库产物以分离纯化后，与链霉素-亲和素磁珠结合，此时dsDNA通过生物素与磁珠上的链霉素结合，然后用0.15 mo I/L的NaOH使dsDNA变性解链，带有生物素的一条链与链霉素结合留在磁珠上，而不带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可实时监测的固相SELEX方法，其特征在于：通过将筛选靶标固定于固相载体聚苯乙烯微量反应板中，将下游端标记过生物素的单链核苷酸库与之相结合，经过温育反应冲洗之后，加入链霉素亲和素‑荧光物质鉴定本轮筛选的效果，用特定的洗脱液将已结合的ssDNA洗脱并扩增，用于下一轮筛选，直到最终筛选出能特异结合靶标的核酸适配体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王方雨，张改平，胡骁飞，赵东，职爱民，史西保，邓瑞广，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南;41