本发明专利技术公开了一种从糖蜜中提取生物素的方法，以糖蜜和硅藻土为原料，经甲醇提取，N,N-二甲基甲酰胺提取，无水乙醇洗涤除杂，丙酮除杂，氯仿除杂，乙酸丁酯和环己烷提取除杂，最终得到含生物素的样品液。本发明专利技术还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法，(1)取待检测样品液，点在硅胶板上，向展开缸加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点；(3)利用薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，计算出样品液中生物素的质量浓度。具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种从糖蜜中提取生物素的方法，以糖蜜和硅藻土为原料，经甲醇提取，N,N-二甲基甲酰胺提取，无水乙醇洗涤除杂，丙酮除杂，氯仿除杂，乙酸丁酯和环己烷提取除杂，最终得到含生物素的样品液。本专利技术还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法，(1)取待检测样品液，点在硅胶板上，向展开缸加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点；(3)利用薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，计算出样品液中生物素的质量浓度。具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。【专利说明】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化、脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动态的物质，是制糖工业上不能再用来煮制糖品的废料，但糖蜜中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加剂，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源。但由于其中生物素的含量与糖蜜的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须密切关注糖蜜的组成变化，准确测定其中的生物素含量，以实现谷氨酸发酵中对生物素用量的控制。现有技术文献报 道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法等等。目前，对糖蜜中生物素的检测，微生物法和高效液相色谱法最为常用，但存在以下缺陷:微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。高效液相色谱法投资大、溶剂用量大、成本较高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有杂质较多，故样品处理即生物素的提取纯化过程困难，且高效液相色谱法对样品的纯度要求又较高，对成分复杂、色素含量高、杂质干扰大的糖蜜样品，不宜用该法检测。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种从糖蜜中提取生物素的方法，本专利技术还提供了一种薄层层析扫描检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种从糖蜜中提取生物素的方法，步骤如下:(I)以糖蜜和硅藻土为原料制得糖蜜硅藻土粉:取糖蜜和硅藻土，混合混匀，40~60°C烘干，得糖蜜硅藻土粉；其中，糖蜜和硅藻土的重量比为3:1~3 ;(2)向糖蜜硅藻土粉中加入甲醇，搅拌提取30~60min，过滤得滤渣；所述甲醇的加入量为--每I克糖蜜硅藻土粉加入3~5ml甲醇；(3)向上述滤渣中加入N，N- 二甲基甲酰胺，在水浴70~100°C下搅拌提取I~2小时，过滤得上清液和滤渣；滤渣用无水乙醇洗涤I~3次，得乙醇洗涤液；所述N，N- 二甲基甲酰胺的加入量为:每I克滤渣加入4~6mlN，N-二甲基甲酰胺；所述无水乙醇的加入量为:每次洗涤所用无水乙醇的量为N，N- 二甲基甲酰胺体积的0.8~1.2倍；(4)合并步骤(3)所得上清液和乙醇洗涤液，蒸发浓缩，加入3?5倍量(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，再次蒸发浓缩，加入3?5倍量(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，再次蒸发浓缩，加入3?5倍量(体积倍数)的氯仿，静置，过滤除去沉淀，得提取液；(4)向提取液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与提取液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液(含有生物素的溶液)。以上方法中，蒸发浓缩采用旋转蒸发仪进行，旋转蒸发的温度为40?60°C。一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下:(I)取待检测样品液(即上述方法制备得到的生物素溶液)4μ1，点在硅胶板(优选IOcmX IOcm的涂有娃胶GF254高效薄层板)上，向展开缸加入展开剂，在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内展开,展开剂的饱和时间为60分钟,展开距离为6cm,展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μ I不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为I?3:1?3:1?2:0.04?0.06，优选3:3:2:0.06 ；所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列标准品溶液；所述生物素标准品溶液的配制方法为:精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液；(2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1?0.2% (质量体积分数，单位g/ml)，硫酸终浓度为I?2% (质量体积分数，单位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点(橙红色)；(3)利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，扫描速度为20mm/s,分辨率为50 μ m/step,得Rf = 0.69 ;照射灯为钨灯，检测计算得到生物素标准品溶液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件winCATSl.4.1计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中生物素的质量浓度。 本专利技术的生物素的提取方法，操作简单、可靠，本专利技术的生物素的检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1以糖蜜为原料进行生物素的提取将15g糖蜜和5g硅藻土搅拌均匀，在40°C烘干得到干燥的糖蜜硅藻土粉，加入60ml甲醇，在常温下搅拌I次，搅拌时间30分钟，之后进行过滤。向已处理的糖蜜硅藻土粉中加入80mlN，N- 二甲基甲酰胺，在水浴锅中进行搅拌提取，温度在75°C，时间为I小时，过滤得到上清液,并用无水乙醇洗涤滤渣,每次80ml，洗涤3次，合并上清液和洗涤液。混合液过滤后用旋蒸仪蒸发浓缩到50ml，加150ml丙酮，搅拌混匀后静置，沉淀出部分杂质，过滤后再次用旋蒸仪蒸发浓缩到40ml，再向其中加入120ml丙酮，搅拌混匀后静置，沉淀出部分杂质，过滤后用旋蒸仪浓缩，浓缩到30ml，加入90ml的氯仿，搅拌混匀后静置，过滤后旋蒸浓缩到3ml ;与3ml乙酸丁酯和3ml环己烷混合，静置分层，取上清液浓缩到2ml，即为生物素溶液(作为样品液)。所述旋转蒸发温度为55°C。实施例2以糖蜜为原料进行生物素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从糖蜜中提取生物素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)以糖蜜和硅藻土为原料制得糖蜜硅藻土粉：取糖蜜和硅藻土，混合混匀，烘干，得糖蜜硅藻土粉；其中，糖蜜和硅藻土的重量比为3：1～3；(2)向糖蜜硅藻土粉中加入甲醇，搅拌提取30～60min，过滤得滤渣；所述甲醇的加入量为：每1克糖蜜硅藻土粉加入3～5ml甲醇；(3)向上述滤渣中加入N,N‑二甲基甲酰胺，在水浴70～100℃下搅拌提取1～2小时，过滤得上清液和滤渣；滤渣用无水乙醇洗涤1～3次，得乙醇洗涤液；所述N,N‑二甲基甲酰胺的加入量为：每1克滤渣加入4～6mlN,N‑二甲基甲酰胺；所述无水乙醇的加入量为：每次洗涤所用无水乙醇的量为N,N‑二甲基甲酰胺体积的0.8～1.2倍；(4)合并步骤(3)所得上清液和乙醇洗涤液，蒸发浓缩，加入3～5倍量的丙酮，静置，过滤除去沉淀，再次蒸发浓缩，加入3～5倍量的丙酮，静置，过滤除去沉淀，再次蒸发浓缩，加入3～5倍量的氯仿，静置，过滤除去沉淀，得提取液；(4)向提取液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与提取液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯木香，刘代成，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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