在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物制造技术

提供了重组的微生物细胞，其经改造而通过脂肪酸生物合成途径产生具有线性链的脂肪酸衍生物，所述线性链含有奇数的碳原子。还提供了利用所述重组微生物细胞制备奇数链脂肪酸衍生物的方法以及包含通过此类方法产生的奇数链脂肪酸衍生物的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在重组微生物细胞中制备奇数链脂肪酸衍生物相关申请的交叉引用本申请是部分连续申请，并且要求2011年9月14日提交的美国申请系列第13/232,927号和2010年9月15日提交的美国临时专利申请第61/383,086号的权益，其通过引用以全文明确并入本文中。通过引用并入电子递交材料本申请含有通过EFS-Web以ASCII格式递交的序列表，其通过引用全文并入本文。所述ASCII副本，创建于2012年3月7日，名称为LS0033PC.txt，大小为350,776字节。专利技术背景原油是含有多种碳氢化合物的非常复杂的混合物。其通过精炼厂中的多种化学过程转变成多种燃料和化学品。原油是运输燃料的来源，也是生产石油化学品的原材料来源。石油化学品用于制备特定的化学品如塑料、树脂、光纤、弹性体、药品、润滑剂和凝胶。最重要的运输燃料——汽油、柴油和喷气燃料，含有特别不同的碳氢化合物混合物，所述碳氢化合物均向最佳的引擎性能方面调整。例如，汽油包含范围通常为约4至12个碳原子的直链、支链和芳香族碳氢化合物，而柴油主要包含范围为约9至23个碳原子的直链碳氢化合物。柴油燃料质量通过诸如十六烷数、动力学粘度、氧化稳定性和浊点评估(KnotheG.,FuelProcessTechnol.86:1059-1070(2005))。此外，这些参数受到碳氢化合物的长度以及碳氢化合物的分支程度和饱和度的影响。可以通过遗传操作调整由微生物产生的脂肪酸衍生物。代谢改造使得微生物菌株能够产生脂肪酸衍生物的各种混合物，其可以被优化，例如，以符合或超出燃料标准或其他商业相关产品规格。可以改造微生物菌株以产生通常源自石油的化学或前体分子。在一些情形下，期望模拟已存在产品的产品概况，例如已存在的石油来源的燃料或化工产品的产品概况，以用于有效的嵌入兼容性或替代。本文所述的重组细胞和方法阐述了微生物生产具有各种比例的奇数：偶数长度链的脂肪酸衍生物，作为精确控制例如基于碳氢化合物的燃料和化工产品的结构和功能的手段。人们需要石油产品的划算的替代物，其不需要勘探、提取、长距离运输或大量的精炼，并避免与石油加工相关的各种类型的环境破坏。由于类似的原因，人们需要通常源自石油的化工产品的替代来源。人们还需要从可再生能源生产高质量生物燃料、燃料替代物和化工产品的有效和划算的方法。经改造以产生具有期望链长(如具有奇数个碳的链)的脂肪酸前体分子和从其制备而来的脂肪酸衍生物的重组微生物细胞、利用这些重组微生物细胞制备包含具有期望酰基链长和期望奇数：偶数长度链比例的脂肪酸衍生物的组合物的方法，以及通过这些方法生产的组合物解决了这些需要。专利技术概述本专利技术提供了产生奇数链长度脂肪酸衍生物的新的重组微生物细胞，和包含此类新重组微生物细胞的细胞培养物。本专利技术还提供了生产包含奇数链长度脂肪酸衍生物的组合物的方法(包括培养本专利技术的重组微生物细胞)、通过这类方法制备的组合物和进一步审查后显而易见的其他特征。在第一个方面，本专利技术提供了重组微生物细胞，其包含编码具有有效增加细胞内丙酰辅酶A的产生的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加是相对于缺少或具有减少量的所述酶活性的亲代微生物细胞的丙酰辅酶A的产生，其中当所述细胞在碳源存在下、于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。所述重组微生物细胞包含：(a)编码具有有效在所述重组微生物细胞中产生增加量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加量是相对于缺少或具有减少量的所述酶活性的亲代微生物细胞产生的丙酰辅酶A的量，其中所述多肽为所述重组微生物细胞外源性的，或相比所述亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调节；(b)编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶(“FabH”)活性的多肽的多核苷酸，和(c)编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中当所述细胞在碳源存在下、于有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物。在一些实施方案中，根据(a)的多核苷酸中的至少一个的表达通过所述多核苷酸的过表达而被调节，如通过将所述多核苷酸可操作地连接至外源性启动子。在一些实施方案中，由第一方面的微生物细胞产生的组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中、于有效表达(a)、(b)和(c)的多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L奇数链脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，根据(a)的重组微生物细胞中编码具有有效产生增加量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸选自：(i)一个或多个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性或苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；(ii)一个或多个编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性或β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和(iii)一个或多个编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性或甲基丙二酰辅酶A差向异构酶活性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述微生物细胞包含一个或多个根据(i)的多核苷酸和一个或多个根据(ii)的多核苷酸。在一些实施方案中，所述微生物细胞包含一个或多个根据(i)和/或(ii)的多核苷酸，和一个或多个根据(iii)的多核苷酸。在一些实施方案中，具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述重组微生物细胞外源性的。在更具体的实施方案中，所述重组微生物细胞内源性的、具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的表达被减弱。所述脂肪酸衍生物酶活性可以为内源性的(“天然的”)或外源性的。在一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括硫酯酶活性，并且由所述重组微生物细胞产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪酸和偶数链脂肪酸。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酸为奇数链脂肪酸。在一些实施方案中，当在含有碳源的培养基中，于有效表达所述多核苷酸的条件下培养时，所述重组微生物细胞产生至少50mg/L、至少75mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少500mg/L、至少1000mg/L、至少2000mg/L、至少5000mg/L或至少10000mg/L的奇数链脂肪酸。在第一方面的一些实施方案中，所述脂肪酸衍生物酶活性包括酯合酶活性，并且由所述重组微生物产生的脂肪酸衍生物组合物包含奇数链脂肪酯和偶数链脂肪酯。在一些实施方案中，所述组合物中至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的脂肪酯为奇本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组微生物细胞，其包含：(a)编码具有在所述重组微生物细胞中有效产生增加的量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加的量是相对于缺少或具有减少的量的所述酶活性的亲代微生物细胞中产生的丙酰辅酶A的量，其中所述多肽为所述重组微生物细胞外源性的，或其中相比所述亲代微生物细胞中所述多核苷酸的表达，所述重组微生物细胞中所述多核苷酸的表达被调节，(b)编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β‑酮酯酰‑ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，和(c)编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸的条件下，在碳源存在下培养时，所述重组微生物细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物，并且其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少10％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.14 US 13/232,9271.重组细菌细胞，其包含：(a)编码具有在所述重组细菌细胞中有效产生增加的量的丙酰辅酶A的酶活性的多肽的多核苷酸，所述增加的量是相对于缺少或具有减少的量的所述酶活性的亲代细菌细胞中产生的丙酰辅酶A的量，其中所述多肽为所述重组细菌细胞外源性的，或其中相比所述亲代细菌细胞中所述多核苷酸的表达，所述重组细菌细胞中所述多核苷酸的表达被调节，其中(a)所述的多核苷酸选自：(i)一个或多个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、高丝氨酸激酶活性、苏氨酸合酶活性和苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；(ii)一个或多个编码具有(R)-柠苹酸合酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和(iii)一个或多个编码具有甲基丙二酰辅酶A变位酶活性、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性和甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶活性的多肽的多核苷酸；(b)编码具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的多核苷酸，和(c)编码具有脂肪酸衍生物酶活性的多肽的多核苷酸，其中于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸的条件下，在碳源存在下培养时，所述重组细菌细胞产生包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物，其中所述脂肪酸衍生物酶活性选自硫酯酶活性、酯合酶活性、脂肪醛生物合成活性、脂肪醇生物合成活性和碳氢化合物生物合成活性；并且其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少10％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。2.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其中所述脂肪酸衍生物组合物中至少20％的所述脂肪酸衍生物为奇数链脂肪酸衍生物。3.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其中所述细胞产生至少100mg/L的奇数链脂肪酸衍生物。4.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其中(a)所述的多核苷酸中的至少一个的表达通过所述多核苷酸在所述重组细菌细胞中的过表达而被调节。5.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其包含一个或多个(i)所述的多核苷酸，以及一个或多个(ii)所述的多核苷酸。6.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其中所述具有利用丙酰辅酶A作为底物的β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽为所述重组细菌细胞外源性的，并且所述重组细菌细胞内源性的具有β-酮酯酰-ACP合酶活性的多肽的表达被减弱。7.如权利要求1所述的重组细菌细胞，其中所述脂肪酸衍生物酶活性包括(a)硫酯酶活性，并且所述重组细菌细胞产生包含奇数链脂肪酸的脂肪酸组合物，其中所述组合物中至少10％的脂肪酸为奇数链脂肪酸；(b)酯合成酶活性，并且所述重组细菌细胞产生包含奇数链脂肪酯的脂肪酯组合物，其中所述组合物中至少10％的脂肪酯为奇数链脂肪酯；(c)脂肪醛生物合成活性，并且所述重组细菌细胞产生包含奇数链脂肪醛的脂肪醛组合物，其中所述组合物中至少10％的脂肪醛为奇数链脂肪醛；(d)脂肪醇生物合成活性，并且所述重组细菌细胞产生包含奇数链脂肪醇的脂肪醇组合物，其中所述组合物中至少10％的脂肪醇为奇数链脂肪醇；或(e)碳氢化合物生物合成活性，并且所述重组细菌细胞产生包含偶数链碳氢化合物的碳氢化合物组合物，其中所述组合物中至少10％的碳氢化合物为偶数链碳氢化合物。8.包含权利要求1所述的重组细菌细胞的细菌细胞培养物。9.制备包含奇数链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物的方法，所述方法包括：获得权利要求1所述的重组细菌细胞，于有效表达(a)、(b)和(c)所述的多核苷酸，并产生包含奇数链脂肪...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷斯·J·李，约翰·R·哈利伯顿，胡志浩，安德烈亚斯·W·席尔默，
申请(专利权)人：LS九公司，
类型：发明
国别省市：美国;US