本发明专利技术公开了一种规模化构建雌雄异体型双壳贝类自交系的新方法。本发明专利技术通过单体精子获取，超低温精子冷冻，利用贝类时间上性逆转特性，收集雄性转化为雌性个体的卵子，之后激活冷冻精子与同一个个体卵子受精、孵化，获得了来自于同一个个体子代，即成功构建了自交系。本发明专利技术不同于传统上筛选空间上雌雄异体型贝类中雌雄同体个体构建自交系的习惯，实现了多种雌雄异体型贝类自交系规模化构建，加快雌雄异体型贝类基因纯化速度，缩短品种培育周期，为纯系（新品种）构建奠定了坚实基础。本发明专利技术无异源基因倒入、具有操作简便、实用性强、易于推广等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术通过单体精子获取，超低温精子冷冻，利用贝类时间上性逆转特性，收集雄性转化为雌性个体的卵子，之后激活冷冻精子与同一个个体卵子受精、孵化，获得了来自于同一个个体子代，即成功构建了自交系。本专利技术不同于传统上筛选空间上雌雄异体型贝类中雌雄同体个体构建自交系的习惯，实现了多种雌雄异体型贝类自交系规模化构建，加快雌雄异体型贝类基因纯化速度，缩短品种培育周期，为纯系（新品种）构建奠定了坚实基础。本专利技术无异源基因倒入、具有操作简便、实用性强、易于推广等优点。【专利说明】
:本专利技术属于海洋农业中贝类苗种繁育
，具体涉及。
技术介绍
:双壳贝类大多为雌雄异体型，如蛤、蚶、蛏、贻贝、牡蛎等；少数种类为雌雄同体型，如海湾扇贝等。雌雄异体型贝类正常情况下一个个体仅会产生单一性别，生殖腺发育成熟后一个个体仅能产生一种配子，即卵子或精子；雌雄同体型贝类每一个个体在性腺发育时会同时产生两种类型配子，即卵子和精子。贝类经常会发生性逆转现象，所谓的性逆转是指贝类体内既有雄性生殖器官又有雌性生殖器官，只是一般会表现出一种，而当某些时候，被抑制的另一个器官被激发，从而显示另一种性别的现象。对于大多数的贝类而言，均会发生性逆转传现象，可分为时间上性逆转和空间上性逆转两种形式。时间上性逆转是指在不同时间段内，同一个个体会出现不同的性别，为环境依赖性性逆转现象，如巨蛎属牡蛎、珍珠贝等；空间上性逆转是指在性腺不同部位发生不同性别，即雌雄同体贝类，如海湾扇贝等。本专利技术针对的是会发生时间上性逆转的贝类，在同一繁殖期内具有不同的性别分化雌雄异体型贝类。雌雄同体型贝类单个个体自繁即可以获得自交系，但对于雌雄异体型贝类而言，自交系相对难于构建。目前，仅发现2个对比文件，刘晓(2004)及刘文广等(2011)利用雌雄异体型贝类中 发现的少量雌雄同体个体成功构建了自交系。对比文件虽然可以构建自交系，但大多数情况下，雌雄异体型贝类中雌雄同体比例相对较低，一些特殊种类甚至难于发生，故自交系构建仍然面临重重困难。尤其是，在雌雄异体型贝类中筛选到的雌雄同体个体，大多数情况均是精子数量庞大、卵子数量极少，受精过程中胚胎畸形率较高，获得的自交系子代数量过少，难于存活。
技术实现思路
:本专利技术的目的是为了解决当前雌雄异体型贝类自交系难于建立的现状，提供。本专利技术具有操作简便、实用性强、高效易行等优点，这为双壳贝类纯系构建及其新品种培育奠定了坚实理论与实践基础。本专利技术的规模化构建雌雄异体型双壳贝类自交系的新方法，其特征在于，包括以下步骤:a、获取精子:雌雄异体型双壳贝类的亲贝性成熟时，采用阴干、流水刺激使其排放配子，当其开始排放配子时，抓取单体雄性个体，利用淡水冲洗干净后，单个放置一个盛满新鲜海水的容器中，使其继续排放精子，获得单个个体的精子；b、冷藏精子:将获取的单个个体精子经过沉淀、浓缩，利用超低温冷冻保存技术冷藏贝类精子；同时，将每一个雄性个体编号，选择该物种环境适宜的条件继续饲养下去；C、收集卵子:翌年繁殖季节时，有一定比例的雄性个体会转为雌性，发生时间上性逆转现象，因此当b步骤继续饲养的个体性成熟时，采用阴干、流水刺激使其排放配子，当其排放配子时，挑出雌性个体，淡水冲洗干净，之后放置于盛满新鲜海水的容器中，收集单体卵子或对于能剖取卵的种类(牡蛎、珍珠贝等)，可直接解剖获取单体卵子；d、受精孵化:活化b步骤中冷冻精子，然后再与c步骤中对应的同一个个体的卵子受精，实现同一个个体精卵受精结合，成功建立了自交系。其受精卵可以正常孵化、按照该物种的常规培育方法即可获得自交系子代。与对比文件相比，本专利技术采用的是同一个个体精子，经过低温冷藏，继续培育该个体至性成熟，筛选出发生性逆转现象的雌性个体获取卵子，之后激活冷冻精子与同一个个体的卵子受精、孵化，产生子代，构建自交系。具有适用范围广、可行性强、易于推广等优点。本专利技术与对比文件不同，具有以下主要创新点:①本专利技术采用单体精子低温冷藏、激活与其时间上发生性逆转的雌性个体卵子受精建立自交系，而对比文件采用的是空间上雌雄相同个体自繁建立自交系，其方法完全不同；②本专利技术适用于所有雌雄异体的双壳贝类，而对比文件仅限于肉眼可以区分性腺的雌雄异体型贝类；③本专利技术可以根据实际需求，大规模构建雌雄异性贝类中任意个体的自交系，而对比文件仅可以选用极个别雌雄同体个体建立自交系。本专利技术通过单体精子获取，超低温精子冷冻，利用贝类时间上性逆转特性，收集雄性转化为雌性个体的卵子，之后激活冷冻精子与同一个个体卵子受精、孵化，获得了来自于同一个个体子代，即成功构建了自交系。本专利技术不同于传统上筛选空间上雌雄异体型贝类中雌雄同体个体构建自交系的习惯，实现了多种雌雄异体型贝类自交系规模化构建，加快雌雄异体型贝类基因纯化速度，缩短品种培育周期，为纯系(新品种)构建奠定了坚实基础。本专利技术无异源基因倒入、具有操作简便、实用性强、易于推广等优点。【专利附图】【附图说明】:图1为本专利技术的技术路线图。【具体实施方式】:以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1a、获取精子:2012年 7月，菲律宾蛤仔亲贝性成熟，在大连庄河海洋贝类育苗场采用阴干3h、流水刺激0.5h的方法刺激亲本排放配子。当其开始排放配子时，抓取单体雄性个体，利用淡水冲洗干净后，单个放置一个盛满IOOmL新鲜海水的烧杯中，使其继续排放精子，获得单体个体的精子。b、冷藏精子:将获取的单个个体精子经过沉淀、离心机浓缩，按照李纯(李纯.海洋经济动物精子超低温保存的研究.青岛:中国科学院海洋研究所硕士学位论文，2000)的超低温冷冻保存技术冷藏菲律宾蛤仔精子，共计冷冻90份单个个体的精子。同时，将每一个雄性个体进行编号，在大连庄河海洋贝类育苗场虾池中继续饲养下去。C、收集卵子:翌年7月繁殖季节时，有70%的雄性个体发生性逆转现象，转为雌性，此时将b步骤的这些在大连庄河海洋贝类育苗场虾池中继续饲养的菲律宾蛤仔采用阴干3h、流水刺激0.5h的方法刺激亲本排放配子，当其排放配子时,挑出雌性个体,淡水冲洗干净，之后放置于盛满2L新鲜海水的容器中，收集单体卵子。将单体卵子放置30min，之后进行镜检，弃掉被污染卵子，使用尚未污染的单体卵子，共获得52份单体卵子。d、受精孵化:活化b步骤中冷冻精子，取出b步骤中液氮冷冻的与雌性相对应的精子，在40°C恒温水浴锅解冻，之后利用0.05%氨海水解冻的精子，发现有30-60%左右精子被成功激活，与c步骤中对应的同一个个体卵子受精，实现同一个个体精卵受精结合，受精率^ 80%，共计建立了 45个自交系。其受精卵可以正常孵化(孵化率> 90%)，之后按照菲律宾蛤仔常规培育方法，成功培育出39个蛤仔自交系。实施例2a、获取精子:2012年5月，紫贻贝亲贝性成熟，在大连海洋大学农业部重点实验采用阴干2h、流水刺激0.4h的方法刺激亲本排放配子。当其开始排放配子时，抓取单体雄性个体，利用淡水冲洗干净后，单个放置一个盛满IOOmL新鲜海水的烧杯中，使其继续排放精子，获得单体个体的精子。b、冷藏精子:将获取的单个个体精子经过沉淀、离心机浓缩，按照李纯(李纯.海洋经济动物精子超低温保存的研究.青岛:中国科学院海洋研究所硕本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种规模化构建雌雄异体型双壳贝类自交系的新方法，其特征在于，包括以下步骤：a、获取精子：雌雄异体型双壳贝类的亲贝性成熟时，采用阴干、流水刺激使其排放配子，当其开始排放配子时，抓取单体雄性个体，利用淡水冲洗干净后，单个放置一个盛满新鲜海水的容器中，使其继续排放精子，获得单个个体的精子；b、冷藏精子：将获取的单个个体精子经过沉淀、浓缩，利用超低温冷冻保存技术冷藏贝类精子；同时，将每一个雄性个体编号，选择该物种环境适宜的条件继续饲养下去；c、收集卵子：翌年繁殖季节时，有一定比例的雄性个体会转为雌性，发生时间性逆转现象，因此当b步骤继续饲养的个体性成熟时，采用阴干、流水刺激使其排放配子，当其排放配子时，挑出雌性个体，淡水冲洗干净，之后放置于盛满新鲜海水的容器中，收集单体卵子或对于能剖取卵的种类，可直接解剖获取单体卵子；d、受精孵化：活化b步骤中冷冻精子，然后再与c步骤中对应的同一个个体的卵子受精，实现同一个个体精卵受精结合，成功建立了自交系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张跃环，肖述，张扬，喻子牛，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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