用于PCR系统的新型去污剂的设计和开发技术方案

本公开涉及用于多种方法包括例如核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)的新型去污剂。还描述了用于制备改性去污剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本公开涉及用于多种方法包括例如核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)的新型去污剂。还描述了用于制备改性去污剂的方法。【专利说明】用于PCR系统的新型去污剂的设计和开发与相关申请的交叉参考本申请在35U.S.C.§ 119(e)下要求2011年6月8日提交的标题为"Design andDevelopment of Novel Detergents for Use in PCR Systems"的美国临时专利申请N0.61/494，812 (将其公开内容通过引用以其全部并入本文)的权益。领域本公开涉及用于多种方法包括例如核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)的改性去污剂。还描述了用于制备改性去污剂的方法。背景 许多广为人知的重组DNA技术涉及复制或聚合和/或扩增DNA。一个此种实例是聚合酶链式反应(PCR)。在PCR过程中，在热稳定DNA聚合酶存在时在两个温度低温与高温(例如，55°C与95°C)之间重复地循环反应。在反应过程中在高温下花费的总时间取决于循环的总数、每一个循环的高温步骤的持续时间和斜坡速度(ramp speed)(即，热循环仪从一个温度变成另一个温度的速度)。虽然用于PCR的DNA聚合酶是高度热稳定的，但它们倾向于在高温下随时间变得失活。此外，这些聚合酶还可因被引入具有次优浓度的辅因子，或具有次优的PH水平，或包括化学或生物抑制剂的存在的反应混合物环境而变得失活。在这种条件下稳定酶的一种方式是添加稳定剂例如表面活性剂。表面活性剂例如去污剂是表面活性化合物，其稳定酶的活性形式与其液体环境之间的界面。例如，通过添加非离子型去污剂例如NP-40或TTween? 20稳定了 Taq DNA聚合酶的活性(Bachmann,等ANuc.Acids Res.18(5):1309(1990))。然而,在一些应用中，Tweeij.20-稳定化的 DNA聚合酶具有低的扩增效率或导致非特异性产物的扩增。此外，一些去污剂需要高的浓度。此外，还已知一些去污剂(例如，NP-40)具有毒性。因此存在对改善热稳定DNA聚合酶在溶液中的稳定性的去污剂、特别是改善酶稳定性而不赋予目前使用的去污剂的任何弊端的去污剂的需要。附图概述本申请中显示的所有扩增曲线图解地将核酸扩增表示为作为循环次数(X-轴)的函数的ARn(y_轴)。图1.使用根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的IKb和3Kb PCR产物进行的不同浓度的新型去污剂Dtl和Dt2的滴定。图2.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在新型去污剂Dtl和Dt2存在时进行的视紫红质基因的扩增。图3.对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的0.1-1Kb PCR 产物，对 0.004% 和 0.0002% 的新型去污剂 Dt2 相较于NP- 40/Tween? 20进行的比较。图4.对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的l_2KbPCR产物，对0.004%和0.002%的新型去污剂Dt2相较于Mp.40/T\veen ° 20进行的比较。图5.PCR活性:对于根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的视紫红质基因产物进行的新型去污剂Dt2与单独的Brij-58的比较。图6.使用根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案扩增的Rhod-1043靶序列进行的新型去污剂Dt2和Dt4的滴定。图7.Dt4与Tween? 20的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的β-2微球蛋白(Β2Μ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、大核糖体蛋白(RPLPO)和葡糖醛酸酶β (⑶SB)的扩增。图8.Dt4与1'veC 20(对数标度)的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的B2M、GAPDH、RPLPO和⑶SB的扩增。图9.Dt4与Tween.20的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，通过Cq表示的不同PCR产物的扩增效率。图10.Dtl、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7与TweeiZ 20的比较:根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的扩增。图11.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和T-ein? 20 (每一种的0.001%和0.0008%)的活性的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRTl)的扩增反应的扩增曲线。图12.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween |i: 20 (每一种的0.0006%和0.0004%)的活性的HPRTl的扩增反应的扩增曲线。图13.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween- 20(每一种的0.001%和0.0008%)的活性的肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)的扩增反应的扩增曲线。图14.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tweene 20 (每一种的0.0006%和0.0004%)的活性的PPIA的扩增反应的扩增曲线。图15.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较Dt4与Brij-58和Tween 20 (每一种的0.0002%和0.0001%)的活性的PPIA的扩增反应的扩增曲线。图16.根据本文中 公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较ο.002%Dt4与0.01%和Tween? 20的活性的B2M的扩增反应的扩增曲线。图17.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较0.002%Dt4与0.01%和Τννθ?、Η? 20的活性的GAPDH的扩增反应的扩增曲线。图18.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案进行的比较0.002%Dt4与ο.01%和Tween? 20的活性的rplpo的扩增反应的扩增曲线。图19.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(Cq) (ACTB(肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。图20.根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(δ Rn) (ACTB(肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。图21.两个不同的 Dt4 批次与 Tween? 20 (Cq, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的扩增反应)的比较。根据本文中公开的方法和组合物的某些示例性实施方案，在两个月中以约I周的间隔进行的显示聚合酶在5X缓冲液中的稳定性的扩增反应(Cq) (ACTB (肌动蛋白-β )、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图示。图22.两个不同的 Dt4 批次与 Tween? 20 ( δ Rn, RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGKl (磷酸甘油酸酯激酶I)、B2M、⑶SB和HPRTl的扩增反本文档来自技高网...

【技术保护点】
式I的化合物：其中：R1是H、(C1‑C30)烷基、(C1‑C30)取代的烷基、(C1‑C30)杂烷基、(C1‑C30)取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、苯基、取代的苯基，其中所述取代的芳基或取代的苯基被至少一个(C1‑C30)烷基、(C1‑C30)取代的烷基、(C1‑C30)杂烷基、或(C1‑C30)取代的杂烷基取代；R2和R3各自独立地是H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；R4和R5各自独立地是H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C=CHNH(C6H5)、CH2C=CHN=CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)=NH，或者R4与R5一起形成任选地被至少一个(C1‑C30)烷基、(C1‑C30)取代的烷基、(C1‑C30)杂烷基、(C1‑C30)取代的杂烷基取代的5‑或6‑元环；和每一个n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·昂里希，Z·杨，J·王，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US