本发明专利技术提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用，所述抗菌肽具有选自序列表SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤作用，且具有结构简单、人工合成方便特点。它可以应用于抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用。
技术介绍
中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。国内外学者发现两栖动物皮及其分泌物含有丰富的抗菌肽，这类多肽通常含有10～50个氨基酸残基，成熟的多肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌肽由于富含碱性氨基酸而带净正电荷。抗菌肽具有很多优点：消炎、抗感染、抗真菌、抗肿瘤、促进伤口愈合等作用，这些功能使抗菌肽可能成为良好应用前景的临床候选药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用，所述抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤作用，其具有结构简单、合成成本低和抗菌谱系广等优点。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ <br>ID NO:1所示的核苷酸序列。所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。本专利技术还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。所述抗菌肽BG-LW18在6.25ug/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。所述抗菌肽BG-LW18在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。所述抗菌肽BG-LW18在25μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了具有广谱抗菌活性的抗菌肽BG-LW18，并将本专利技术的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同成熟肽，所述抗菌肽BG-LW18具有创新性。本专利技术通过实验证明两栖动物来源的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤的作用，尤其是对临床耐药肿瘤细胞有很好的抑制作用，且应用范围广泛，与其它来源的抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特点。可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。附图说明图1是本专利技术中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍抗菌肽的成熟序列。图2表明本专利技术抗菌肽BG-LW18对肝癌细胞HepG2的作用。图3表明本专利技术抗菌肽BG-LW18对乳腺癌细胞MCF-7的作用。图4表明本专利技术抗菌肽BG-LW18对脑神经瘤细胞Neuro-2a的作用。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。实施例1一、中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的基因克隆1、总RNA的提取将中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴乙醚，收集毒液腺分泌物（也可以直接使用收集好的毒液腺分泌物），立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加入10ml总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品），于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4℃,12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4℃,12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。2、mRNA的分离采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取中华大蟾蜍毒腺总RNA500μg溶于500μl经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65℃水浴10分钟。加入3μl的Oligo（dT）探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠（SA-PMP）的洗涤：将磁珠（随mRNA分离纯化试剂盒）轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次。然后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15ml DEPC水重新悬浮,至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管,则上清中为纯化的mRNA。加入1/10体积的3M乙酸钠,pH5.2,等体积异戊醇,于-70℃放置30分钟,然后于4℃，12000rpm离心10分钟,弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。3、cDNA文库构建。采用美国GIBCO/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。3.1、cDNA第一链合成（mRNA反转录）：于1.5ml试管中加入2.0μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl5×第一链合成缓冲液，2μl0.1M DTT，1μl10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反转录酶，于42℃保温1小时后放入冰浴。3.2、cDNA第二链合成：在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl5×第二链合成缓冲液，3μl10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T4DNA多聚酶继续保温5分钟。3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取180μl上层溶液转移到干净的试管中，加入70μl7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇本文档来自技高网...
【技术保护点】
中华大蟾蜍抗菌肽BG?LW18，其具有SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
2.含有权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，其特征在于：使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，
所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；
所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。
【专利技术属性】
技术研发人员：孙同毅，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：
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