纯化GLA结构域凝血蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤：a)将含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触，所述亲和支持体上固定了特异性结合多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，以便在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)中形成的复合体释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述GLA结构域凝血蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质纯化领域，特别涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的领域。现有技术一般而言，GLA结构域蛋白形成具有共同结构-GLA结构域-的蛋白质家族，GLA结构域由位于这些蛋白质N末端的区域组成，并且包含多个谷氨酰胺残基，它们特别羧化产生羧基谷氨酸或“GLA”残基。GLA结构域蛋白一般包括被称为前肽的N端部分，该部分被维生素K依赖性的羧化酶识别。在GLA结构域的谷氨酰胺残基羧化后，前肽被蛋白水解切割，释放出成熟和活性的GLA结构域蛋白。根据考虑的蛋白质，GLA结构域由约45个氨基酸组成，其中包括9至12个谷氨酰胺残基，它们通常被羧化而产生Gla。GLA结构域蛋白由“维生素K依赖性”的蛋白质组成。GLA结构域蛋白涵盖了凝血因子、骨组织蛋白和芋螺毒素(conopeptides)。GLA结构域凝血因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、C蛋白和S蛋白。GLA结构域蛋白，包括维生素K依赖性GLA结构域蛋白，在Furie等人(1999，Blood，Vol. 93 :1798-1808)的文章中特别介绍。维生素K依赖性的GLA结构域凝血蛋白由目的治疗性蛋白组成。在所述蛋白质中，因子II、因子VII、因子IX和因子X代表具有极大治疗性目的的蛋白质，被施用用于预防和治疗多种内稳态功能障碍。可以从天然的人体液中，一般是从人血浆中纯化人GLA结构域凝血蛋白。此外，为了开发出生产和纯化重组人GLA结构域凝血蛋白的方法，已进行了大量研究。例如可提及已作为药物销售的重组人因子VII。关于获得从生物液体中纯化的GLA结构域蛋白(其中这些蛋白质是天然生产的或以重组蛋白的形式生产的)，合适的纯化方法是现有技术中已知的。这些方法一般包括一系列的选择性分离步骤，所述选择性分离是基于蛋白质沉淀和通过层析支持体的步骤，再通过顺序洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤或者浓缩步骤。用于纯化目前用于生产药物的GLA结构域凝血蛋白的方法不包括亲和层析步骤。此类技术选择的一个原因是存在这样的缺陷，所述缺陷是由于一部分移植到亲和支持体上的配体分子脱落造成的，脱落的配体分子发现在层析洗脱液体积中与纯化的治疗性蛋白质相结合。作为示例，可提及产品Mononine ,这是基于纯化的人因子IX的药物组合物，所述人因子IX是通过使用固定了小鼠抗fix单克隆抗体的免疫亲和支持体的方法获得的。然而，Mononine 产品的专题文章明确说明在最终产品中存在微量的小鼠抗人Fix单克隆抗体，所述抗体能够在治疗患者体内导致免疫原性问题，因为患者变得对“可滤去物”(小鼠抗体和抗体片段)免疫。Mononiiie 产品的专题文章明确说明对小鼠蛋白质过敏的患者的禁忌症。一般现有技术需要改善的或替代的方法，用于纯化维生素K依赖性GLA结构域凝血蛋白。这涵盖了对替代或改善的方法的需求，所述方法用于获得包括单一的纯化蛋白质例如因子VII或因子IX的组合物，以及用于获得包含GLA结构域蛋白的组合的组合物，例如包括因子II、因子VII、因子IX和因子X的组合的组合物的备选或改进方法。这涵盖了对备选或改进的方法的需求，所述方法用于纯化非重组的GLA结构域蛋白或重组的GLA结构域蛋白。专利技术概述本专利技术涉及用于纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触,所述亲和支持体上固定了特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，以便在(i)所述核酸适配体和Qi)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)形成的复合体中释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述生物学GLA结构域凝血蛋白。在上述方法中，所述适配体优选是脱氧核糖核酸适配体。在上述方法中，所述GLA结构域蛋白可以是维生素K依赖性的凝血因子，例如选自因子II、因子VII、因子IX、和因子X。在这些方法的某些实施方案中，所述核酸适配体由SEQ ID NO. 4的序列的适配体组成。附图简介图I是包含通过使用亲和支持体层析纯化血浆因子IX期间获得的连续级分中所含的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像。泳道I :起始材料；泳道2 :没有保留的级分(NR)；泳道3 :洗脱级分(El);泳道4 :再生级分(E2);泳道5 :纯化的因子IX参考对照；泳道6 已知分子量的参考蛋白质。图2显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，(i)在各种组合物中存在的因子VII、因子IX或因子X，分别与(ii)特异性针对固定在支持体上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。I号曲线人重组因子IX的制品(BeneFIX ) ;2号曲线人血浆因子Vll的制品；3号曲线人血浆因子X的制品；4号曲线阴性对照制品。图3显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，本专利技术的多种核酸与固定在支持体上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。曲线“I”:低亲和力核酸；曲线“2”中等亲和力核酸；曲线“3”高亲和力核酸；曲线“4” 非常高亲和力核酸。图4显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，核酸适配体“Mapt-1. 2. -CS”和“Mapt-1. 2. -CS0”与固定在支持体上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿y轴共振信号，按任意共振单位表示。I号曲线是用Mapt-L 2. -CS适配体获得的结合曲线；2号曲线是用Mapt-1. 2. -CSO适配体获得的结合曲线。图5显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿y轴254纳米的吸光值(0. D.)。(I):注射人血浆FIX浓缩液的时刻；⑵非滞留级分的消除峰；(3):纯化的FIX的洗脱峰；(4):在层析支持体再生步骤的过程中产生的峰。 图6是包含在人血浆因子IX的纯化级分中的蛋白质，在不含还原剂的、具有4%至12%双丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右泳道1( “SM”)起始组合物，人血浆因子IX浓缩液；泳道2 ( “NR”)包含在不滞留在亲和支持体上的级分中的蛋白质；泳道3(“E1”)包含在洗脱级分El中的蛋白质；泳道4( “E2”)包含在亲和支持体输出的、再生缓冲液中的蛋白质；泳道5( “E3”)包含在亲和支持体输出的、再生缓冲液中的蛋白质；泳道6(“T FIX”)人血浆因子IX的纯化级分。图7显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿y轴254纳米的吸光值(O.D.)。(I):非滞留级分；(2):纯化的人FIX洗脱峰；(3):层析支持体的再生峰。图8是包含在人血浆因子IX的纯化级分中的蛋白质，在不含还原剂的、具有4% 至12%双丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·佩雷，S·什图鲁，N·比霍罗，
申请(专利权)人：LFB生物技术公司，
类型：发明
国别省市：