本发明专利技术属于生物医药检验技术领域，具体涉及一种检测Ｓ亚型人肌纤维生成调节因子１含量的酶联免疫吸附测定试剂盒，由以下试剂组成：抗人ＭＲ－１Ｓ抗体预包被板１块或ＭＲ－１Ｓ抗原预包被板１块；抗人ＭＲ－１Ｓ抗体酶标记液１瓶；系列浓度的人ＭＲ－１Ｓ标准液；阳性质控液、阴性质控液、生理盐水各１支；洗涤液；样品稀释液；封闭液；底物液；终止液。本发明专利技术与现有技术相比，所建立的试剂盒的检测结果显示，对ＭＲ－１Ｓ浓度可实现定量检测，检测结果可反映人ＭＲ－１Ｓ的变化范围和发展趋势，满足临床诊断和治疗监测需求，且可在１２０分钟内完成测试，试剂、方法稳定、操作简便，灵敏度高、特异性较强，有较好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药检验
，具体涉及一种检测S亚型人肌纤维生成调节因子1含量的酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
当前，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清或血浆中的肿瘤标志物(tumor marker)，简称TM，由于TM的检测较为经济，取材方便、检查时创伤小，且适合大批量标本检测，在临床恶性肿瘤患者的病情监测、预后评估中有较好的应用价值。中国疾控中心的最新统计资料表明，由于人们饮食结构、生活环境及方式的改变， 恶性肿瘤，特别是卵巢癌、大肠癌、肝癌等发病近年呈上升趋势。任开环等的研究(J Bio Chem, 2008; 283(51) 35598-35605.)以及我们前期的研究均发现，一种新的肿瘤标志物-S亚型人肌纤维生成调节因子1 (Myofibrillogenesis Regulator-I S, MR-1S，以下均简称“MR-1S”)与恶性肿瘤，如卵巢癌、肝癌的发生、发展与密切相关，更与肿瘤细胞的粘附、转移息息相关。MR-I是一个新近报道的人类功能基因，该基因在转录过程中可形成3 条长度不同的剪接异构体，即MR-1L、MR-1M和MR-1S，分别含10、9和3个外显子，其中S亚型MR-I (Short-type MR-I)即MR-IS的长度最短而得名；MR-IS mRNA全长75^3ρ，可编码一个142个氨基酸组成的蛋白质，第75至92位点18个氨基酸形成一疏水跨膜结构区域， 为一种膜蛋白；MR-IS可与转录起始因子3 (initiation factor 3)以及具有ADP核糖基化因子(ARF)功能的蛋白(MRIPl)相互作用，其中转录因子的高表达可加速细胞进入细胞周期，增加细胞分裂的速度。因而，临床恶性肿瘤诊疗中需要这一敏感、有效的标志来辅助诊断、监测病情。该肿瘤标志物目前还没有市售的抗体及抗原，首先采用分子生物学的方法，获得 MR-IS的融合蛋白，具有了较好的免疫原性；免疫动物获得了抗体；为制备检测MR-IS的试剂盒提供合适的、有保证的原料。常用的测定肿瘤标志物的方法有酶免疫法、放射免疫法、化学发光免疫法等所述的定量测定法等，已在诸多肿瘤标志物中有所应用，如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA等。但到目前为止，MR-IS作为一种潜在的、有较好的临床应用前景的肿瘤标志物其测定方法至今未见公开报道。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA)是目前临床的较认可的一种检测手段，其快速、操作简便、试剂稳定、不易污染等特点而得到广泛应用，适用于肿瘤高危人群的筛查以及肿瘤患者的随访测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服以往肿瘤标志物检测在临床应用中的不足，其中特别是在卵巢癌临床诊疗中缺乏敏感、有效的肿瘤标志物，提供了一种检测人MR-IS的试剂盒，更具体涉及一种检测人MR-IS含量的酶联免疫测定试剂盒。为实现上述目的，本专利技术设计一种一种检测人血浆中MR-IS含量的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成抗人MR-IS抗体预包被板1块或MR-IS抗原预包被板1块，抗人MR-IS抗体预包被板中的包被物为浓度为50 500 μ g/ml的抗人MR-IS抗体；MR-IS抗原预包被板中包被物为 1 10 μ g/ml的人MR-IS融合蛋白； 抗人MR-IS抗体酶标记液1瓶；系列浓度的人MR-IS标准液，即采用如下浓度的人MR-IS融合蛋白作为标准液1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml> 187. 5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml 各 1 支；阳性质控液为含人MR-IS融合蛋白的磷酸盐溶液PBS、阴性质控液为0. 9%的生理盐水各1支，所述的含人MR-IS融合蛋白的浓度为300 ng/ml ；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为 0. 01mol/L、pH 值为 7. 4 ；洗涤液采用2. 42g的三羟基氨基甲烷Tris、i;3ml的0. 1 mol/L的HCl和0. 5 ml的 Tween-20混合而成；样品稀释液为 0.2 g 的 KH2P04、2.9 g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0.2g 的 KC1、 0. 5 ml的Tween-20和IOg的牛血清白蛋白BSA混合后加蒸馏水至1000 ml所构成； 封闭液采用上述配方的PH 9. 6的碳酸盐缓冲液100 ml，再加入Ig BSA混合而成； 底物液为由A液和B液组成，所述的A液由5. 1 ml的0. lmol/L的Na2HPO4和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4. 9 ml的0. 05 mol/L的柠檬酸和0. 05 ml的30%的H2R 混合而成；终止液采用2mol/L的H2SO4,即177. 6 ml蒸馏水中加入22. 4 ml的98%的浓H2SO4而成。所述的抗人MR-IS抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述的预包被板采用聚苯乙烯板或聚氯乙烯板或聚氯乙烯酰胺板材质的96微孔板。 所述的抗人MR-IS抗体酶标记液中所采用的酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶 ALP。 所述的试剂通过下列步骤制备而成试剂盒a、人MR-IS融合蛋白的制备抽提卵巢癌患者的血液基因组DNA，以分子克隆的方法， 即从血液基因组DNA中用PCR扩增目的基因人MR-1S，双酶切后与同样双酶切的原核表达载体 pET21a ( + )或 PGEX-4T-1，构建 pET2Ia-MR-IS 或 PGEX-4T-I-MR-IS 重组质粒，转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导MR-IS-His融合蛋白或MR-IS-GST融合蛋白表达，亲和纯化后^festern blot鉴定，MR-IS-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白浓缩后，用 0. 01mol/L、pH7. 2的PBS透析活化，冷冻干燥成冻干粉，得到人MR-IS融合蛋白，_20°C保存；b、抗人MR-IS抗体的制备及纯化用上述纯化得到的人MR-IS融合蛋白免疫动物，制备特异的高效价的抗人MR-IS的抗体，并使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化；c、将抗人MR-IS抗体或作为抗原的人MR-IS融合蛋白与包被液混勻后，包被96微孔板，所述的包被液采用由Na2CO3 0. 16g，NaHCO3 0. 29 g加蒸馏水至100 ml制得的pH 9. 6的碳酸盐缓冲液；d、上述包被好的96微孔板，过夜，吹干，再用封闭液封闭，吹干，加一包干燥剂，用铝箔袋封好，得抗人MR-IS抗体预包被板或MR-IS抗原预包被板；e、抗人MR-IS抗体酶标记液的制备采用过碘酸钠标记法试剂以过碘酸标记法制备， 即通过调整所获得的抗人MR-IS抗体的pH值，再将酶标记于该抗体，然后储存于10 ml塑料瓶；f、组合成检测人MR-IS的酶联免疫吸附测定试剂盒将上述d步骤中封好的铝箔袋、上述制备而得的抗人MR-IS抗体酶标记液1瓶；系列浓度的人MR-IS标准液6支；阴性、阳性质控液各1支；样品稀释液1瓶；洗涤液1瓶；底物液A液、底物液B液和终止液各1瓶，置于一个纸制的外包装盒内。步骤b中所述的人MR-IS融合蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测人血浆中ＭＲ－１Ｓ含量的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：抗人ＭＲ－１Ｓ抗体预包被板１块或ＭＲ－１Ｓ抗原预包被板１块，抗人ＭＲ－１Ｓ抗体预包被板中的包被物为浓度为５０～５００μｇ／ｍｌ的抗人ＭＲ－１Ｓ抗体；ＭＲ－１Ｓ抗原预包被板中包被物为１～１０μｇ／ｍｌ的人ＭＲ－１Ｓ融合蛋白；抗人ＭＲ－１Ｓ抗体酶标记液１瓶；系列浓度的人ＭＲ－１Ｓ标准液，即采用如下浓度的人ＭＲ－１Ｓ融合蛋白作为标准液：１５００ ｎｇ／ｍｌ、７５０ ｎｇ／ｍｌ、３７５ ｎｇ／ｍｌ、１８７．５ ｎｇ／ｍｌ、９３．８ ｎｇ／ｍｌ、０ ｎｇ／ｍｌ各１支；阳性质控液为含人ＭＲ－１Ｓ融合蛋白的磷酸盐溶液ＰＢＳ、阴性质控液为０．９％的生理盐水各１支，所述的含人ＭＲ－１Ｓ融合蛋白的浓度为３００ ｎｇ／ｍｌ；所述的磷酸盐溶液ＰＢＳ的浓度为０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值为７．４；洗涤液采用２．４２ｇ的三羟基氨基甲烷Ｔｒｉｓ、１３ｍｌ 的０．１ ｍｏｌ／Ｌ的 ＨＣｌ和０．５ ｍｌ 的Ｔｗｅｅｎ－２０混合而成；样品稀释液为０．２ ｇ 的ＫＨ２ＰＯ４、２．９ ｇ 的Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ、８．０ｇ 的ＮａＣｌ、０．２ｇ 的ＫＣｌ、０．５ ｍｌ 的Ｔｗｅｅｎ－２０和１０ｇ的牛血清白蛋白ＢＳＡ混合后加蒸馏水至１０００ ｍｌ所构成；封闭液采用上述配方的ｐＨ ９．６的碳酸盐缓冲液１００ ｍｌ，再加入１ｇ ＢＳＡ混合而成；底物液为由Ａ液和Ｂ液组成，所述的Ａ液由５．１ ｍｌ的０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＨＰＯ４和４ ｍｇ邻甲苯胺混合而成，所述的Ｂ液由４．９ ｍｌ的 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸和０．０５ ｍｌ 的３０％的Ｈ２Ｏ２混合而成；终止液采用２ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２ＳＯ４，即１７７．６ ｍｌ蒸馏水中加入２２．４ ｍｌ的９８％的浓Ｈ２ＳＯ４而成。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢仁泉，
申请(专利权)人：上海永昶医学诊断用品有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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