用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用，属于分子生物学领域，所述的引物组合如表1所示。本发明专利技术还提供利用上述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，采用SDS法提取刺参样品的DNA，以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体；群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。刺参群体。刺参群体。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及鉴定“安源1号”刺参群体的分子鉴定标记引物组合及应用。

技术介绍

[0002]刺参是我国传统高端保健食品，在我国辽宁、山东广泛养殖，是我国海水养殖的支柱产业，年产量保持在20万吨左右，产业链长，产品多元化，年产值达到300
‑
400亿元。截止2021年，经全国水产原种与良种委员会审定，农业农村部公告，刺参“安源1号”(GS
‑
01
‑
014
‑
2017)获批国审水产新品种并推广，刺参“安源1号”是以棘刺数数量超过50个且生长速度快的“水院1号”为亲本，以棘刺数量、体重和出肉率为选育目标，经过连续4代选育而成。在相同的养殖条件下，与普通刺参相比，“安源1号”刺参体表颜色呈褐色或黑褐色，棘刺数量多且长度较长，生长速率快，加工出成率高，目前已在山东、辽宁、福建沿海广泛推广养殖，经济效益显著，市场上已有冒充“安源1号”海参幼苗，扰乱市场，开发可用于鉴别“安源1号”刺参的分子标记不但可有效解决纠纷，而且对规范海参市场，有效开展刺参种质资源保护具有重要意义。
[0003]单核苷酸多态性(SNPs)标记作为第三代分子标记，为共显性标记，具有较高的多态性，可通过测序技术快速检测。本研究利用重测序数据进行“安源1号”特有SNP位点挖掘，结合KASP分型技术设计可用于鉴别“安源1号”刺参的引物组合，为刺参新品种“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。r/>
技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题在于基于重测序技术和KASP分型技术提供一共可用于鉴别“安源1号”刺参群体的SNP标记的引物，应用此引物可以成功鉴别“安源1号”刺参群体和个体。
[0005]为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，所述引物组合见表1：
[0007]表1用于鉴定“安源1号”刺参的SNP标记引物组合
[0008][0009]本专利技术提供利用上述3组引物用于鉴定刺参新品种“安源1号”群体的方法，所述方法具体如下：
[0010]采用SDS法提取刺参样品的DNA，以KASP组合标记进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。
[0011]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
[0012]本专利技术利用重测序数据进行刺参“安源1号”群体特有SNP位点挖掘，结合KASP分型技术设计可用于鉴别刺参“安源1号”群体的引物组合，为刺参“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。
附图说明
[0013]图1为使用本专利技术引物鉴别待检刺参群体的分型图(显示部分结果)。
具体实施方式：
[0014]下面通过实施例来对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0015]实施例1
[0016]1“安源1号”刺参特异性SNP标记获取
[0017]1.1样本选择
[0018]采集刺参新品种“安源1号”、山东烟台、山东牟平、山东长岛县、山东威海、辽宁大连、辽宁庄河7个有代表性的刺参养殖、野生群体共256只。
[0019]1.2提取DNA
[0020]采用SDS法进行基因组总DNA的提取。试剂盒选用TIANGEN amp Marine Animals DNA Kit(TIANGEN，中国北京市)，提取刺参的肌肉组织，以1％的琼脂糖凝胶电泳初步检测核酸的纯度和完整度，合格的DNA样品主带清晰，无降解或轻度降解。经检验合格的刺参DNA样品质量浓度调至约100ng/ul保存。
[0021]1.3基因组重测序
[0022]检测合格的样本采用Bioruptor Pico超声破碎仪随机打断成350bp的片段，然后利用基因组DNA文库构建试剂盒进行文库制备。按照以下步骤进行文库构建：
[0023](1)通过Bionuptor Pico超声破碎仪将基因组DNA的打断；
[0024](2)DNA片段末端补平:将基因组末端修复成平末端，并在5'末端加磷酸基团；
[0025](3)DNA片段3
’
末端加'A'；
[0026](4)DNA末端连接adaptor:通过TA连接将adaptor添加到DNA片段两端；
[0027](5)PCR扩增:将添加完接头的连接产物进行PCR扩增形成可进行测序的文库。
[0028]构建完成的文库通过Qubit文库浓度定量、琼脂糖电泳检测文库大小特征和qPCR对文库的有效浓度进行准确定量3种方式进行文库质检，质检合格的文库进行浓度均一化，并在Illumina HiSeq2500测序平台上进行高通量测序。
[0029]1.4 SNP获取与质控
[0030]在得到clean reads后，采用BWA软件将clean reads与参考基因组(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/754/855/GCA_002754855.1_ASM275485v1/)比对。使用软件GATK(v3.8)对样本进行群体SNP检测，并对获得的结果进行过滤，过滤标准为
“‑‑
minQ 200
‑‑
minDP 3
‑‑
min
‑
meanDP 3
‑‑
max
‑
missing 0.8
‑‑
maf 0.05”。
[0031]1.5关联分型
[0032]使用Plink软件进行基因组关联分析，
[0033]“安源1号”刺参和其他种群的刺参分为两个亚群。
[0034]采用Logistic模型进行关联分析，获得每个SNP对应的显著性P值，使用Bonferroni对获得的P进行校正，最终获得“安源1号”刺参显著关联SNP位点。
[0035]1.6 KASP引物设计
[0036]根据上述“安源1号”显著SNP位点设计出42对PCR 3
’
末端特异性扩增引物，设计软件为Primer 5，每个序列需要3条引物，即两条特异的上游引物和一条通用的下游引物。引物设计原则为：(1)引物自身无发夹结构，上下游引物之间不会形成引物二聚体；(2)引物的GC含量在40～60％，Tm值在55～65℃之间。
[0037]2 KASP标记验证
[0038]2.1验证群体DNA提取和标记检测
[0039]随机选“安源1号”刺参，其他群体刺参各15只，以SDS法提取DNA，在Dougla本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，其特征在于所述引物组合见下表2.利用权利要求1所述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，其特征在于所述方法具体如下：采用SDS法提取刺参样品的DNA，以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型，检测“...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁君，常亚青，国超，王荦，宋坚，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：