一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用。特别涉及一种在粮谷装卸、中转、加工场所中收集环境空气中微生物气溶胶，应用实时荧光PCR技术快速检测气溶胶中是否有产毒真菌，在真菌毒素产生早期、甚至在真菌毒素未产生前，评判粮谷及制品受产毒真菌污染的风险，有效提高真菌毒素危害预测能力。本发明专利技术对于早期预警粮谷中真菌毒素污染具有快速、灵敏、准确的特点。准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种食品检测方法，特别涉及一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用。

技术介绍

[0002]粮食是安天下、稳民生的基础物质。目前，粮食安全已经纳入国家战略。在世界贸易摩擦不断加剧的新形势下，保障国家粮食安全是长期而艰巨的任务。
[0003]真菌毒素一直是世界粮食安全的重大突出问题。真菌毒素是由真菌次生代谢产生的有毒物质，其广泛存在并难以降解，人和动物一次性摄入含一定量的真菌毒素的食物会发生急性中毒，甚至发生突然死亡；真菌毒素被人或动物摄入后很难排出体外，容易在体内富集产生严重的致癌、致畸和致突变作用。目前，针对真菌毒素导致的食品安全问题监控主要依靠真菌毒素含量的检测，检测方法主要是理化方法，包括气相色谱、液相色谱等，但这些检测方法都存在检测设备昂贵、检测需要昂贵的标准品、检测成本高、操作复杂、检测周期长等问题；同时受毒素提取效率和检测灵敏度等的限制，这些检测方法仅在毒素积累到一定浓度的情况下才能够检出，其检测结果仅可作为事后处理提供技术支撑，无法实质性挽回经济损失、降低其健康危害。
[0004]粮谷中的真菌毒素主要是粮谷储存过程中温度和湿度等环境条件变化，加上粮谷本身的新陈代谢等原因，粮谷中有真菌生长，真菌生长繁殖到一定程度，开始产生真菌毒素，对人体产生更大的危害。粮谷表面均携带一定量的真菌，如果样品被产毒真菌污染，但由于温湿度等条件不适宜产毒真菌的生长，或不适合毒素合成，此时样品中无法检测到真菌毒素，一旦条件适宜，这类样品中的真菌大量快速繁殖并产生大量的真菌毒素。因此，针对于真菌毒素污染导致的食品安全问题，其关键在于开展真菌毒素产生的源头——产毒真菌的检测。目前针对粮谷中真菌污染检测方法较少，对于产毒真菌的检测仍主要依赖于形态学分析，参考标准只有《GB4789.16
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2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定》和《SN/T 1035
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2011进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法》，这些检测方法都需要进行真菌培养，检测过程需要10～20天，试验操作繁冗，耗时费力，而且极易因近缘种间的形态相似性而导致真菌鉴定结果的误判，需要检测人员具有丰富的鉴定经验，且方法仅限于对可能产毒的真菌进行分类鉴定至“种”，不能实质性探究其是否产毒，靶向性不强。最重要的是，这些检测方法均受采样量的限制，不能全面检测、评判储备粮仓各部位或吨位级进出口粮谷真实的污染情况。因此，对粮谷中真菌毒素的污染情况进行监控，研发早期风险预测技术，实现粮食安全风险爆发前早预测、扩散前早发现、危害前早处置对确保粮食质量安全具有重要意义。
[0005]空气中气溶胶(aerosol)是指一种固态或液态的各种微粒状化学物质及其悬浮在各种气体化学介质中所形成的分散体系。生物气溶胶主要包括细菌、霉菌孢子、寄生虫卵、各种原生菌类毒素和它们的细胞碎片以及它们的分泌物等。早在1833年，就有国外学者报道采集到了空气中的霉菌孢子；1908年Science报道了第1篇空气中有关细菌的液体撞击采
集的新方法。在粮谷食品安全早期监测及预警领域，由于现有的产毒真菌及真菌毒素检测方法并不能满足粮食真菌毒素早期预警的需要，当检测出粮谷样品中有超过限量的真菌毒素时，真菌毒素已经污染了大部分粮食。但是如何应用气溶胶进行粮谷霉变及真菌毒素早期监测的相关研究却未有报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的不足之处，为了克服现有技术存在的检测周期长、检测成本高、需要昂贵的仪器和标准品、以及无法及时准确的进行粮谷霉变及真菌毒素早期监测等主要问题。本专利技术建立了一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法，采用在粮谷装卸、中转、加工场所中收集环境空气中气溶胶，应用实时荧光PCR技术快速检测粮谷霉变产生的气溶胶中是否有产毒素真菌，在真菌毒素未产生前及产生早期预测粮谷及其制品受产毒真菌污染并产生真菌毒素的风险。验证试验结果表明，本专利技术建立的应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法准确率高，灵敏稳定性好，明显优于传统的粮谷中真菌培养鉴定方法及粮谷中真菌毒素液相和气相等理化检测方法，实现粮谷中真菌毒素污染的早期监测。
[0007]为了实现粮谷中真菌毒素污染早期风险预警，将空气气溶胶中真菌采集与产毒真菌分子生物学快速检测技术相结合，利用液体撞击式空气微生物采样器采集粮谷在装卸、中转、加工等关键环节所产生的生物气溶胶，特异性检测气溶胶中的真菌毒素生物合成关键调控基因，利用实时荧光PCR技术快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌，在真菌毒素合成早期甚至未合成前评判粮谷及制品受产毒真菌污染的风险，有效提高对真菌毒素危害的预测能力，预防毒素污染可能引发的经济损失及健康危害，最大程度减轻其可能造成的不良后果。
[0008]本专利技术建立了玉米霉变模型，收集了玉米霉变产生的微生物气溶胶，采用高通量测序技术分析并确定气溶胶中真菌种类与粮谷样品中真菌种类相一致；针对粮谷中主要产毒真菌，包括黄曲霉、寄生曲霉、黄色镰孢菌和串珠镰孢菌，建立产毒真菌污染粮谷样品模型，模拟粮谷装卸过程，收集微生物气溶胶，采用实时荧光PCR方法快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌。
[0009]本专利技术为了验证所建立的气溶胶中产毒真菌检测方法可用于粮谷真菌毒素污染的早期预警，对受真菌污染但尚未检测到真菌毒素的样品进行验证试验。第一步，选取已受真菌污染的粮食(玉米、大米、花生)实际检测样品，利用液体撞击式空气微生物采样器收集微生物气溶胶，检测气溶胶中是否含有产毒真菌，对真菌毒素的产生进行早期预警；第二步，对于霉变样品进行霉变加速培养，采用高效液相色谱或高效液相色谱串联质谱法检测样品中是否存在真菌毒素，与第一步中气溶胶早期检测结果相比较，验证本专利技术所述粮谷中真菌毒素污染发生前的早期预警方法的可行性。
[0010]本专利技术的目的是提供一种粮食储存环境中应用气溶胶早期预警真菌毒素污染的方法。包括如下步骤：采集粮食储存环境中的生物气溶胶；分别取采样器中收集到的气溶胶采集液及同一环境下的已污染真菌毒素的样品，应用实时荧光PCR技术快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌，比较气溶胶和已污染真菌毒素样品中的产毒真菌的一致性；根据气溶胶中产毒真菌的鉴定和实时荧光PCR技术检测结果判断粮谷及制品中产毒真菌的污染情
况。实现粮谷中真菌毒素污染早期预警的目的。本专利技术具有快速灵敏等优点，满足了粮谷中真菌毒素污染早期迅速准确预警的需求。
[0011]所述的采集粮食环境中的生物气溶胶是通过液体撞击式空气微生物采样器进行采集的；还可以辅以采用GB4789.16
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2016和SN/T 1035
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2011方法进行产毒真菌的鉴定。
[0012]进一步优选的，本专利技术采用真菌基因组高通量测序方法同时对气溶胶中收集到的真菌和已污染真菌毒素的粮食样品中的真菌进行基因组测序，比较气溶胶中真菌组分与已污染真菌毒素的粮食样品中的真菌组分是否相同，经验证二者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：在验证了粮食储存环境的气溶胶中真菌组分与同一环境下的已污染真菌毒素的粮食参考样品中的真菌组分具有正相关性基础上；通过采集粮食环境中的微生物气溶胶，根据气溶胶中实时荧光PCR方法检测结果，判断粮谷及其制品中真菌污染情况。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述利用实时荧光PCR技术检测气溶胶中真菌的方法，还包括如下步骤：所述采集粮食环境中的生物气溶胶是通过液体撞击式空气微生物采样器采集；将收集到的气溶胶采集液置于29
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32℃培养过夜，用0.45μm的无菌滤膜过滤，将微生物富集到无菌滤膜上；采用CTAB法或真菌DNA提取试剂盒提取滤膜上真菌总DNA作为检测模板。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述气溶胶中产毒素真菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、黄色镰孢菌和串珠镰孢菌。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述实时荧光PCR方法所用到的真菌毒素生物合成关键调控基因及其核苷酸序列如下：产黄曲霉毒素真菌的aflR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25、omt
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1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.26、ver
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1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.27；产伏马毒素真菌的FUM1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.28、FUM5基因的核苷酸序列如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱馥，郑秋月，曹际娟，黄大亮，梁冰，
申请(专利权)人：大连海关技术中心，
类型：发明
国别省市：