靶向枯否细胞用于治疗癌症的药物组合物制造技术

本发明专利技术提供了用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。将质粒DNA编码的CRISPR/Cas基因编辑系统通过该重组载体递送到枯否细胞中，可对枯否细胞进行原位基因编辑和修饰。通过此方法敲除枯否细胞c

【技术实现步骤摘要】
靶向枯否细胞用于治疗癌症的药物组合物


[0001]本专利技术属于药物递送领域，特别是涉及靶向枯否细胞用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物。

技术介绍

[0002]肝脏独特的双重血供和免疫耐受特性使得肝脏成为肿瘤转移的主要场所。肝转移癌不但易发难治，且对当前以T细胞为主的肿瘤免疫疗法响应较差，因而亟需开发新型治疗方法。
[0003]Kupffer细胞(枯否细胞)作为肝脏驻留的巨噬细胞，占肝脏细胞总数的15％，是机体中数目最多的一群组织巨噬细胞，对肝脏的免疫耐受微环境起着关键的调控作用。Kupffer细胞在肿瘤肝转移早期可以通过大量吞噬清除循环肿瘤细胞行使免疫监视功能，而在肿瘤肝转移后期发生两种截然不同的功能极化：M1(经典)型和M2(替代)型。M1型Kupffer细胞有促进炎症和杀肿瘤的特性；M2型Kupffer细胞有抑制炎症和促肿瘤的特性。因此，靶向枯否细胞进行基因编辑，重塑其免疫功能，对肝转移癌治疗具有广阔前景。
[0004]当前研究主要通过病毒、脂质体、纳米材料或者真菌葡聚糖壳等物质作为载体，靶向递送siRNA、mRNA或质粒DNA等分子对肝脏巨噬细胞实现原位基因编辑。然而，这些方案普遍制备成本较高，操作流程较繁琐，大规模工业化生产难度较大；尤为重要的是体内作用机制复杂，靶向Kupffer细胞的特异性并不高。
[0005]因此，迫切需要研发特异性靶向枯否细胞并可高效实现基因编辑修饰的递送方法。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]一方面，本专利技术提供用于递送药物组合物至枯否细胞的载体，其特征在于，所述载体为细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli。
[0008]在一些实施方案中，所述药物组合物选自用于编辑c
‑
Maf和MafB基因的含有CRISPR/Cas9或CRISPR/CasΦ系统的质粒DNA。
[0009]另一方面，本专利技术提供特异性靶向枯否细胞的递送载体，其特征在于，所述载体为细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli。
[0010]另一方面，本专利技术提供用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
[0011]在一些实施方案中，所述重组载体选自用于基因编辑目的的CRISPR载体，如pX459和pPP441；或用于RNA干扰目的的shRNA载体，如pLKO.1，以及用于基因过表达的真核或原核表达载体，如pEGFPC3或pCM29。
[0012]在一些实施方案中，所述目标基因为c
‑
Maf和MafB。
[0013]在一些实施方案中，所述重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框。
[0014]在一些实施方案中，所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子。
[0015]在一些实施方案中，所述重组载体上还含有CRE酶的核苷酸序列。
[0016]在一些实施方案中，所述重组载体上还含有多克隆位点。
[0017]另一方面，本专利技术提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备促进枯否细胞由M2到M1功能转化的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
[0018]另一方面，本专利技术提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备递送药物组合物至枯否细胞的载体中的用途。
[0019]另一方面，本专利技术提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备用于促进枯否细胞的增殖的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
[0020]另一方面，本专利技术提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变的大肠杆菌菌株，如Clearcoli，在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
[0021]另一方面，本专利技术提供治疗癌症特别是癌症肝转移的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的大肠杆菌，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
[0022]在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肺癌和结肠癌。
[0023]另一方面，本专利技术提供对枯否细胞进行原位基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括向枯否细胞施用有效量的大肠杆菌，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
[0024]在一些实施方案中，所述大肠杆菌表达红色荧光蛋白tdTomato和绿色荧光蛋白zsGreen1。
[0025]定义
[0026]枯否细胞：即Kupffer细胞，是肝脏中的数目最多的驻留型巨噬细胞，占肝脏总细胞数的15％，具有选择性捕获、吞噬和清除血液中冗余毒害物质，特别是细菌等病原微生物的功能。
[0027]CRIg：Complement receptor of the immunoglobulin family，又名V
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set and immunoglobulin domain
‑
containing protein 4(VSIG4)，在肝脏枯否细胞上特异性高表达。具有补体受体、微生物模式识别和T细胞负调控等多重功能。
[0028]F4/80：又名Adhesion G protein
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coupled receptor E1，基因名adgre1。是巨噬细胞表面表达的一种糖蛋白。一般作为标记巨噬细胞的分子标记。
[0029]TIM4：是英文T
‑
cell immunoglobulin and mucin domain
‑
containing protein 4的缩写。磷脂酰丝氨酸的受体，可参与T细胞的激活调控。在肝脏中特异性地表达在枯否细胞表面，可作为区分胚胎来源的枯否细胞和骨髓来源巨噬细胞的标志。
[0030]普通大肠杆菌：在本专利技术中指应用于基因工程中的非致病性大肠杆菌，如Top10等。
[0031]低毒大肠杆菌：本专利技术中指，相较于基因工程大肠杆菌，能够引起更低的免疫应答反应和肝损伤的非致病性大肠杆菌，如Clearcoli等。
[0032]sgRNA：是英文small guide RNA的缩写。在CRISPR/Cas基因编辑系统中，能够引导Cas9切割特定的含有PAM系列(NGG)的双链DNA，从而引发真核生物双链DNA损伤修本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组载体上还含有CRE酶的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述目标基因为c
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Maf和MafB。6.细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌，如Clearcoli在制备用于治疗癌症优选癌症肝转移的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾筑天，刘维，张清，李璐，姚奇，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：