一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑方法及系统技术方案

一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑方法及系统，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的编辑系统包括pMV261

【技术实现步骤摘要】
一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑方法及系统


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑方法及系统。

技术介绍

[0002]甾体类药物已批准上市的有300多种，是人类用于治疗疾病最重要的药品之一。其市场需求巨大，且生产规模逐年增长，这样的趋势归功于它广泛的治疗用途。甾体类药物主要分为两类，性激素和肾上腺皮质激素。其中性激素包括雄性激素，雌激素等，可用于治疗男性性器官功能障碍、妇科疾病和避孕等用途。肾上腺皮质激素包括糖皮质激素，盐皮质激素等，可用于治疗炎症、类风湿性关节炎、休克等症状。除此之外，甾体类药物还广泛应用于抗肿瘤、抗病毒、抗过敏和内分泌失调等疾病的治疗中。
[0003]甾体药物及甾体药物中间体在我国有着较大的生产和出口规模，有关于甾体合成、提取和优良菌种的研究从未中断，但与世界先进国家相比依旧存在着诸多不足，导致在该领域中始终处于市场的中低端地位。因此，急需打破国外在甾体类药物生产与研发的技术垄断。甾体类药物主要来源于各种甾体中间体，是一些包含甾烷核的分子，主要有4
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雄烯
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3，17
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二酮(AD)、1,4
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雄二烯
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3，17
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二酮(ADD)、9
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羟基
‑4‑
雄烯
‑
3，17
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二酮(9
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OH
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AD)、22一羟基
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23，24
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二降胆
‑4‑
烯
‑3‑
酮(4
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HBC)、22
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羟基
‑
23，24
‑
二降胆
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1，4
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二烯
‑3‑
酮(1，4
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HBC)和9，22
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二羟基
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23，24
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二降胆
‑4‑
烯
‑3‑
酮(9
‑
OH
‑4‑
HBC)等(见附图1)。
[0004]当前，微生物转化是制备甾体中间体的常见手段。虽然，化学合成的方法曾经在这一领域中拥有绝对的统治力，但最近的几十年中，正在被具有安全温和、成本低廉、生态友好的生物技术所替代。越来越多的利用微生物修饰类固醇的技术被报道，总体来说，这类技术可以实现在甾醇分子的特定位置引入或者改变需要的基团，且能够保证分子的特异性，并将多个反应步骤集成在一个生物中进行，甚至根据需求设计或创造新的代谢路径。能够合成甾体中间体产物的微生物种类十分繁多，其中放线菌属的新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum,Mn)，可转化植物甾醇制备ADD、HBC和AD等甾体中间体，因具有摄取、利用胆固醇的天然能力，和良好的生长特性，是一种极具潜力的工业化生产菌。
[0005]新金色分枝杆菌从植物甾醇转化为甾体化合物这一过程，涉及十余种酶，路径复杂且繁琐。野生型新金色分枝杆菌很难积累大量的甾体中间体，这就需要利用基因技术改造菌株，如果需要积累HBC，则需要敲除或阻断3
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甾酮
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Δ1
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脱氢酶(Ksdd)、17β胆固醇脱氢酶(Hsd)和3
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甾酮
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9α
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羟化酶(Ksh)这些下游代谢的关键酶(见附图2)。传统的同源重组技术可以实现对这些基因的敲除与整合，但由于新金色分枝杆菌自身重组效率低(10
‑6～10
‑5)的影响，这一技术的使用，存在着操作繁杂、周期长、筛选难、效率低等诸多问题。近些年来，CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术也被引入到新金色分枝杆菌的基因敲除中，可以精准地实施DNA编辑，但受限于DNA双链断开影响生长，同源、非同源修复效率低，大片段敲除扰乱邻近基因表达等缺点。
[0006]单碱基编辑(Base Editing，BE)技术，CRISPR
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n/d Cas9(nCas9：Cas9 D10A，dCas9：Cas9 D10A/H840A)系统不具备DNA链的切割功能，而保留了其特定位点的识别能力，避免了对宿主活性的影响。偶联胞嘧啶脱氨酶，可以将胞嘧啶(C)脱氨生成尿嘧啶(U)，它将被解读为胸腺嘧啶(T)，并在随后的DNA复制中引起G:C到A:T碱基对的转换，可在编码链的特定位置引入终止密码子，起到沉默相关基因的作用。尿嘧啶DNA糖化酶抑制基因(UGI)的表达可以抑制尿嘧啶糖苷酶对U的糖基化，避免细胞内的修复机制对突变位点的修复，提高编辑效率。这将是一种可获得的、简单的、高效的遗传工具，更有利于推动生产甾体的新金色分枝杆菌的改造和研究。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑系统及其应用的技术方案，该专利技术首次在野生型分枝杆菌Mycobacteriumneoaurum ATCC 25795中构建了快速、高效和稳定的rAPOBEC
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n/dCas9
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UGI+sgRNA单碱基编辑系统，对kshA1和kshA2两个基因进行定点碱基编辑，获得可高效积累ADD的基因工程菌株。
[0008]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0009]本专利技术一方面提供了一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑系统，其包括pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒和pTarget
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sgRNA质粒；
[0010]所述pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒通过以下步骤得到：
[0011]以pMV261为骨架，包含分枝杆菌复制子OriM、启动子hsp60、大肠杆菌复制子OriE和终止子rrnB与卡那抗性基因kan，在启动子hsp60和终止子rrnB之间插入rAPOBEC、n(d)Cas9和UGI基因片段，rAPOBEC与n(d)Cas9通过Linker1连接，n(d)Cas9和UGI通过Linker2连接，用Gibson组装的方式形成一个完整可表达的质粒，在大肠杆菌中克隆得到pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒；
[0012]所述pTarget
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sgRNA质粒通过以下步骤得到：
[0013]以pTarget为骨架，包含不同于pMV261的OriM的高拷贝复制子OriMe、潮霉素抗性基因Hyg和大肠杆菌复制子OriE，连接sgRNA基因片段，所述sgRNA为靶向序列，可特异性靶向靶序列，在大肠杆菌中克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑系统，其特征在于包括pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒和pTarget
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sgRNA质粒；所述pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒通过以下步骤得到：以pMV261为骨架，包含分枝杆菌复制子OriM、启动子hsp60、大肠杆菌复制子OriE和终止子rrnB与卡那抗性基因kan，在启动子hsp60和终止子rrnB之间插入rAPOBEC、n(d)Cas9和UGI基因片段，rAPOBEC与n(d)Cas9通过Linker1连接，n(d)Cas9和UGI通过Linker2连接，用Gibson组装的方式形成一个完整可表达的质粒，在大肠杆菌中克隆得到pMV261
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rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒；所述pTarget
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sgRNA质粒通过以下步骤得到：以pTarget为骨架，包含不同于pMV261的OriM的高拷贝复制子OriMe、潮霉素抗性基因Hyg和大肠杆菌复制子OriE，连接sgRNA基因片段，所述sgRNA为靶向序列，可特异性靶向靶序列，在大肠杆菌中克隆得到pTarget
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sgRNA质粒。2.如权利要求1所述的一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑系统，其特征在于所述rAPOBEC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述UGI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述nCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述Linker1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述Linker2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.如权利要求1所述的一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑系统，其特征在于所述pTarget的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述OriMe的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述Hyg的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述OriE的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。4.如权利要求1所述的一种新金色分枝杆菌工程菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，王鑫鑫，柯霞，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：