花烟草NaD1基因启动子及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种花烟草NaD1基因启动子及应用。所述启动子具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了含有所述启动子的载体和宿主细胞，本发明专利技术还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、转基因植物、外植体和愈伤组织，本发明专利技术还公开了所述启动子的用途。其优点在于该启动子中含有光反应元件，光胁迫处理可使NaD1基因在花中的表达有显著变化，研究该启动子调控模式在更高效地利用NaD1蛋白中有重要用途。

Promoter of NaD1 Gene in Tobacco and Its Application

【技术实现步骤摘要】
花烟草NaD1基因启动子及其用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及花烟草NaD1基因启动子及其用途。
技术介绍
启动子是指RNA聚合酶特异性识别和结合，指导基因开始转录的特定DNA序列。真核生物启动子分为核心启动子区和上游序列区两个区域，核心启动区含有转录起始位点和TATA-box等顺式作用元件；上游序列区含有不同的调控表达元件，对基因转录的效率、特异性和活性起关键作用，确保基因转录的有效性和精确性。根据转录模式的不同，启动子可分为组成型、组织特异型和诱导型。了解启动子的元件构成及其功能，对于研究基因的时空表达和转录调控至关重要，此外，因对外源基因表达水平的调控作用，启动子成为基因工程表达载体的重要元件之一。Nicotialaalatadefensin1(NaD1)蛋白是一种来自观赏性花烟草(Nicotianaalata)的植物防御素，它对尖孢镰刀杆菌，灰霉菌，念珠菌等多种致病性真菌具有抗菌活性，并对多种哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用，因此NaD1具有重要的研究价值。对于NaD1的研究主要涉及蛋白功能和作用机制，而其基因调控元件的研究未有报道。其中启动子对基因表达起到重要调控作用，了解其调控模式能有助于更高效地利用NaD1蛋白。本专利技术对花烟草NaD1基因的上游调控序列进行了克隆，以期得到其启动子基本元件的完整序列，对其进行生物信息学分析。通过构建连接缺失启动子片段启动GUS基因表达的植物表达载体，遗传转化花烟草，从而验证启动子的活性。对花烟草NaD1基因的表达模式进行了分析，以期为研究NaD1基因的表达调控模式奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种NaD1基因的光反应原件启动子。花烟草NaD1基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，本专利技术还涉及一种核酸构建体，其包含本专利技术的启动子,与启动子可操作连接的基因序列。进一步的，本专利技术还涉及一种重组载体，所述载体为本专利技术的启动子与pCAMBIA1391zVector质粒经重组所得。进一步的，本专利技术还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根瘤农杆菌细胞。本专利技术启动子制备方法：以花烟草DNA为模板，使用3条特异性引物进行扩增，所述扩增引物按照GenomeWalkingKit说明书进行设计。所述3条特异性引物分别含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列所述引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和保护碱基。进一步的，本专利技术还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本专利技术的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本专利技术的重组细胞。进一步的，本专利技术还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本专利技术的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本专利技术的重组细胞。进一步的，本专利技术还涉及所述启动子或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在高效利用NaD1蛋白中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：提供了一种来源于花烟草NaD1基因的启动子，所述启动子对NaD1基因的表达起到了重要调控作用，该启动子中含有光反应元件，光胁迫处理花烟草使NaD1基因在花中的表达有显著变化，研究该启动子调控模式在更高效地利用NaD1蛋白中有重要用途。附图说明图1为NaD1基因5’端调控区顺式作用元件。图2为重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图。图中，1:2000Marker；2:pNaD1-644；3:pNaD1-310；4:15000Marker。图3为pCAMBIA1391z质粒图谱。图4为载体构建示意图。图中，A:pCAMBIA1391z-PNaD1-644::GUS；B:pCAMBIA1391z-PNaD1-310::GUS。图5为花烟草转化过程。图6为抗性幼苗叶片GUS组织化学染色。图中，1:野生型；2:pCAMBIA1391z-pNaD1-310::GUS；3:pCAMBIA1391z-pNaD1-644::GUS。图7为NaD1基因在花烟草不同组织器官表达量。图8为NaD1基因在不同生长发育阶段的叶片中表达量。图9为不同光处理条件下NaD1基因在花烟草花中的表达量。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。下述所用生物材料均为市售，本申请人实验室有保存，可以对外公开发放。实施例1、启动子的克隆参照魏胜华(2011)中CTAB法对花烟草(植物材料花烟草种子由云南大学生命科学学院陈穗云教授赠予)DNA进行提取。按照GenomeWalkingKit说明书设计3条特异性引物，通过热不对称交错PCR反应克隆NaD1基因上游片段。如表1所示。表1基因启动子扩增的体系表2PCR扩增程序其中，3条特异性引物分别为Na-sp1：5’-AGCTTTTCTGCATGGTGGTTTGG-3’,Na-sp2：5’-GAGACAAACCATAGGCAACAAAGAGC-3’：Na-sp3：5’-GAAGCACAAGGAGCGAGCCATAGT-3’。将第3次PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶中分离,并根据GelExtractionKit说明书回收纯化目的条带,按照pMDTM19-TVectorCloningKit提供的方法克隆到试剂盒自带的pMD19-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株进行扩增，经蓝白斑筛选、PCR和HindIII、KpnⅠ双酶切鉴定后，送交华大基因测序返回。测序结果如SEQIDNO.1所示。实施例2、NaD1基因启动子序列的鉴定和分析根据测序结果设计特异性引物Na-p-644-F/R，Na-p-644-F序列为5’-GTCGACTCAGGTTATTTACTTTTTGGGG-3’(下划线标记为SalΙ酶切位点)，Na-p-644-R序列为5’-GAATTCTGAAGCACAAGGAGCGAG-3’(下划线标记为EcorΙ酶切位点)。以花烟草基因组DNA为模板使用TaqDNAPolymeraseHighFidelityKit扩增其上游片段。其中，PCR反应体系为:Platinum酶1.0μl，10×HighFidelityPCRBuffer2.5μl，MgSO4(50mM)1.0μl，dNTPmix(10mM)0.5μl，上下游引物各0.5μl，DNA1.0μl，ddH2O18.8μl，终体系为25.0μl。PCR反应程序为：94℃预变性2min，(94℃15sec，60℃30sec，68℃1min)5个循环，(94℃15sec，59℃30sec，68℃1min)5个循环，(94℃15sec，58℃30sec，68℃1min)25个循环，68℃延伸10min，12℃保存。将上述扩增产物胶回收并连接至pTMD-19T载体上，送由公司测序后与克隆得到的启动子序列进行比对，克隆得到一条大小为644bp的NaD1基因上游序列，测序结果经过与已知NaD1基因上游序列比对，并通过鉴定发现成功扩增NaD1基因启动子序列。测序所得启动子序列如SEQIDNO.1所示。利用植物顺式作用元件数据库PlantCARE进行相关预测,发现该序列含有启动子基本顺式作用元件TATA-box和CAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.花烟草NaD1基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.花烟草NaD1基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种核酸构建体，包含权利要求1所述的启动子以及与启动子连接的基因序列。3.一种重组载体，由权利要求1所述的启动子与pCAMBIA1391zVector质粒经重组所得。4.一种重组细胞，含有权利要求1所述的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求4的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组细胞，为重组大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵懿琛，赵德刚，龚伟伟，杨玲玲，罗显麟，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52