一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂制造技术

一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂，它涉及一种乳酸菌及其菌制剂。本发明专利技术提供了一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂，解决了现有乳酸菌表面疏水性低以及乳酸菌冻干后活菌数降低的问题。本发明专利技术开菲尔乳杆菌为开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M3；其菌制剂按以下步骤制备：Lactobacillus kefiri M3在MRS培养基中培养后与冷冻保护剂混合进行冻干处理。本发明专利技术的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M3和开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M3菌制剂均具有优异的表面疏水性和凝聚性，对肠道有很好的粘附能力；本发明专利技术的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M3制成菌剂后有效活菌数的数量1.41×10

A Lactobacillus Kefir and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂
本专利技术涉及一种乳酸菌及其菌制剂。
技术介绍
乳酸杆菌是动物肠道内的共生菌，能够帮助消化，有助人体肠道的健康，含有活性乳酸杆菌的食品常被视为健康食品，通常乳酸杆菌添加在酸奶等发酵食品中，用以人体人类肠道中菌群平衡调节。在体内肠上皮细胞可以分泌某种物质(可能是一种蛋白质或脂质磷壁酸)，有利于乳酸杆菌等益生菌在肠黏膜上定植，从而形成菌膜屏障，排斥致病菌在肠壁上的粘附。同时，乳酸杆菌会产生乳酸、乙酸及细菌素，抑制多种致病菌的侵入。因此应用乳酸杆菌代替抗生素防止人类或者动物的肠道疾病已成为当前食品和饲料工业中重要的研究领域。2019年，YANG研究发现鼠李糖乳杆菌GG还可增加仔猪肠道的通透性，并通过调控抗菌肽、细胞因子和趋化因子的分泌以改善肠道的免疫屏障功能。乳酸杆菌的粘附特性是评价乳酸杆菌益生功能的重要指标之一，粘附定植是乳酸杆菌在肠道中发挥生理功能的前提和基础。有学者研究表明微生物细胞表面疏水性和自动聚集能力对菌株的粘附性起着主要的作用，疏水性和自聚能力较高的乳酸杆菌在肠道中也呈现较高的粘附性，即菌体表面疏水性和自聚能力与其对肠道上皮细胞的粘附力成正比。目前，乳杆菌潜在的防治Ⅱ型糖尿病的功能已得到动物体内及临床实验的证实和广泛认可。当机体摄入适量的乳杆菌时，能有效调节能量代谢，降低脂肪和胆固醇堆积，有效补充Ⅱ型糖尿病引起的肠道菌群缺失，建立新的肠道平衡稳态，恢复健康肠道菌群结构，降低肠道渗透性，提高肠道屏障作用，抑制炎症反应，减轻葡萄糖不耐受并提高葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。现有普通乳酸菌的表面疏水性低，粘附性差，影响了其益生功能的发挥。另外，方便使用，将乳酸菌制成菌粉来使用，菌粉一般采用冷冻处理的方法进行制备，冷冻处理后的乳酸菌的有效活菌数的数量会减少，极大的影响了乳酸菌的使用效果。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有乳酸菌表面疏水性低以及乳酸菌冻干后活菌数降低的问题。而提供了一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂。本专利技术开菲尔乳杆菌为开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019079。本专利技术的LactobacilluskefiriM3来源于西藏灵菇，其菌体形态为革兰氏阳性菌、中长杆菌，菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑。本专利技术的开菲尔乳杆菌菌制剂，其制备方法为开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3在MRS培养基中培养至对数生长期离心，去上清留菌体，向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到LactobacilluskefiriM3菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100∶6～7∶1～2∶1～2。经过表面疏水性和自凝能力的测定，本专利技术的开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3和开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3菌制剂均具有优异的表面疏水性和凝聚性，对肠道有很好的粘附能力。本专利技术的开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3制成菌剂后有效活菌数的数量1.41×109，存活率90％以上，其在-20℃条件下保存12周，有效活菌数仍能保持108cfu/mL。本专利技术的开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3为乳酸菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2019年1月24日，保藏号为CCTCCNO：M2019079。附图说明图1是LactobacilluskefiriM3的菌落特征；图2是LactobacilluskefiriM3的菌体特征；图3是LactobacilluskefiriM3的总DNAPCR扩增图；图4为LactobacilluskefiriM3和LactobacilluskefiriM3菌制剂-20℃条件下储存时间对活菌数的影响；图5是LactobacilluskefiriM3在人工胃液中耐受性结果图；图6是LactobacilluskefiriM3在人工肠液中耐受性结果；图7是乳杆菌及菌制剂Ⅱ型糖尿病小鼠实验；图8是开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血清氧化损伤结果；图9是开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠肾脏氧化损伤结果；图10是开菲尔乳杆菌LactobacilluskefiriM3系统发育分析图；图11是开菲尔乳杆菌LactobacilluskefiriM3小鼠肠道菌群的影响。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式开菲尔乳杆菌，其为开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019079。本实施方式LactobacilluskefiriM3分离、纯化及鉴定：一、西藏灵菇菌粒培养1、西藏灵菇菌粒活化：按5％接种量将西藏灵菇菌粒接种到灭菌完达山纯牛奶中，21℃恒温培养24h，将培养后的西藏灵菇发酵液通过灭菌过滤网过滤，保留西藏灵菇菌粒，重复一周；其中西藏灵菇菌粒于2017年采集自黑龙江大学微生物重点实验室。2、西藏灵菇菌粒传代：将活化后的西藏灵菇菌粒按照5％的比例扩大培养到灭菌牛乳中，21℃恒温培养48h，将培养后的西藏灵菇发酵液通过灭菌过滤网过滤，保留西藏灵菇菌粒；每隔48h传代一次，共传代4次；二、乳杆菌分离、纯化2g无菌生理盐水洗净的步骤一中传代后的西藏灵菇菌粒与1mL无菌生理盐水混合放入研钵中，研磨至颗粒直径为1-3mm；将制得的西藏灵菇菌粒分多次转移到10ml的离心管中定容至10ml，涡旋震荡均匀；对菌悬液分别按104、105、106梯度进行稀释。在MRS固体培养基上37℃培养选择具有乳酸菌菌落形态(通常每个样品5至10个菌落)进行革兰氏染色，选择革兰氏阳性细菌并且在电子显微镜下观察为杆状的典型乳杆菌菌体形态，在MRS固体培养基上纯化，分离获得一株乳杆菌，编号为M3。对M3菌株纯化三代。三、对步骤二中纯化后的乳杆菌M3菌株进行鉴定1、细菌DNA的提取按照上海生工生物有限公司的Ezup柱式细菌DNA抽提试剂盒操作说明提取乳杆菌M3菌株的总DNA。2、乳杆菌M3总DNA的PCR扩增PCR扩增引物：5'-TACCTTGTTAGCACTT-3'5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'PCR反应体系(50μL)：10×PCRbuffer10μL，引物对(10μmol/L)各5μL，dNTPMIX(100mmol/L)4μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)2.5μL，ddH2O26.5μL，模板DNA2μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，进行循环35个，72℃延伸10min，4℃下保存。3、琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，称取1g琼脂糖，用1×TAE缓冲溶液配制1.0％琼脂糖电泳凝胶，未凝固时加入溴化乙锭使其终浓度达到1μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液使液面没过胶面。将5μLPCR产物分别和1μL6×loadingbuffer混合，点样，其中一孔加入DNAmarker。电泳30min，紫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种开菲尔乳杆菌，其为开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019079。

【技术特征摘要】
1.一种开菲尔乳杆菌，其为开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019079。2.一种开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3菌制剂，其特征在于该菌制剂按以下方法获得：开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)M3在MRS培养基中培养至对数生长期离心，去掉上清液，然后向菌体中加入脱脂乳、蔗糖和海藻酸钠混合均匀，再冻干处理即得到LactobacilluskefiriM3菌制剂；其中，开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)M3菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠的重量比为100:6～7:1～2：1～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟利，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23