一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒及鉴别方法技术

本发明专利技术涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒及鉴别方法。该试剂盒中包括北沙参探针和桔梗探针，探针均连接有荧光标记。上述探针与模板结合的热动力学效能提高，使每个探针均能够更好地和与之对应中药的DNA结合，而不与另外二者的DNA结合，重复性好，假阳性率低，与DNA杂交后即可通过荧光检测进行北沙参和桔梗与其伪品迷果芹的鉴别，操作简便快捷、成本低。

A Kit and Method for the Identification of Radix Salviae Miltiorrhizae and Platycodon grandiflorum

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒及鉴别方法
本专利技术涉及中药鉴别
，尤其涉及一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒及鉴别方法。
技术介绍
北沙参是一种常用中药，系伞形科植物珊瑚菜的干燥根，具有养阴清肺，祛痰止咳、益胃生津的功效；桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根，具有宣肺祛痰、利咽排脓的功效。由于北沙参、桔梗价格较高，而北沙参、桔梗的外观与迷果芹相似，以致于市场中有人以迷果芹代替北沙参和桔梗进行销售。中药饮片在使用过程中不能随意代替，其伪品严重影响人民用药的安全与疗效。另一方面，药材的实际使用或采购过程中还存在北沙参与桔梗真品无意混淆的情况，给用药带来安全隐患。而当北沙参、桔梗、迷果芹被加工成粉末时，更不易区分。因此，准确鉴别北沙参、桔梗与迷果芹对于中药行业以及人民健康具有重要意义。目前中药常规鉴定方法有基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等，但对于已被加工的中药则有一定的局限性。近年来，以DNA条形码为基础的分子鉴定方法快速发展，成为了继传统鉴定方法后的中药鉴定新方法。现有的分子鉴定技术多基于聚合酶链式反应(PCR)及测序技术：PCR获得ITS2序列后，通过对PCR产物进行测序、比对序列信息，从而能够区分正品和伪品。分子鉴定技术可以保证试验数据的可靠性，且重复性高，结果可靠，从分子水平进行鉴定不受样品的状态及采收加工影响。但是由于需要特殊而昂贵的测序仪器对其进行测序(一般需要由测序公司进行)，其经济成本及易用性限制了其推广的可能性。后又有人利用荧光标记的方式，通过设计特异性引物，在PCR合成过程中于碱基间插入荧光标记以鉴别正品和伪品。该方法从一定程度上改善了原有技术的缺点，但是，全序列标记的荧光标记成本过高，且特异性引物的设计和筛选费时费力，针对不同的待鉴定中药很难获得相应的特异性引物，同样限制了此类技术的推广和应用。
技术实现思路
针对北沙参与桔梗之间以及二者与迷果芹之间可混淆、粉末状不易区分，以及现有技术中分子鉴定方法成本高、不易设计和筛选特异性引物的技术问题，本专利技术提供了一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒。以及，本专利技术还提供了鉴别北沙参和桔梗的方法。以及，本专利技术还提供了上述鉴别北沙参和桔梗的试剂盒在鉴别北沙参与迷果芹，或鉴别桔梗与迷果芹中的应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，包括北沙参探针和桔梗探针，所述北沙参探针和桔梗探针均连接有荧光标记；其中所述北沙参探针的序列为5′-CCGTCGTAGGA-3′(如SEQIDNO.1所示)；所述桔梗探针的序列为5′-CTGCGAGGCAC-3′(如SEQIDNO.2所示)。本试剂盒中的探针序列以北沙参、桔梗与迷果芹的ITS2差异序列中差异较大的序列为基础，经人工设计后得到。与根据差异序列直接得到的探针相比，上述探针与模板DNA结合的热动力学效能提高，使每个探针均能够更好地和与之对应中药的DNA结合，而不与另外二者的DNA结合，重复性好，假阳性率低。将探针与DNA杂交后，即可通过荧光检测进行北沙参和桔梗与其伪品迷果芹的鉴别，包括鉴别其饮片或粉末。本试剂盒利用上述探针可获得准确的鉴别结果，并有效降低了单次反应成本，且不需要特殊检测仪器，大大提升了检测手段的易用性，可在涉及北沙参、桔梗和迷果芹鉴别的科研机构、药房、医院、加工采收厂、中药供应商等地广泛应用。优选地，所述试剂盒还包括植物ITS2引物，用于扩增北沙参、桔梗和迷果芹的基因组DNA。优选地，所述荧光标记连接于所述探针的5′端。一个探针仅连接一个荧光标记，可有效降低荧光基团的使用量，降低成本。优选地，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。以及，本专利技术实施例还提供了一种鉴别北沙参和桔梗的方法，用上述鉴别北沙参和桔梗的试剂盒对北沙参和桔梗进行鉴别。优选地，具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入所述北沙参探针或桔梗探针进行杂交，然后电泳，荧光检测。优选地，所述杂交的方法为：向所述扩增引物中加入所述北沙参探针或桔梗探针，95℃变性5min，60℃退火1min。在优选的变性、退火的温度和时间条件下，能够更好地使探针与对应中药的DNA结合，而不与另二者结合，从而可以将这三种物质鉴别区分。优选地，所述荧光检测的激发波长为488nm。优选地，所述电泳的条件为1％琼脂糖凝胶电泳，电压为180V。优选地，扩增所述基因组DNA的反应体系为：100ng基因组DNA或10ng质粒DNA，ITS2引物10pmol/μL，DNA聚合酶1×，用双蒸水补齐至50μL；反应程序为：95℃5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃，5min，共1个循环；所述北沙参探针或桔梗探针的加入量为1pmol/μL。以及，本专利技术实施例还提供了上述鉴别北沙参和桔梗的试剂盒在鉴别北沙参与迷果芹，或鉴别桔梗与迷果芹中的应用。该试剂盒可用于将北沙参和桔梗与其伪品迷果芹区别开。附图说明图1为本专利技术实施例2中荧光检测结果；图2为本专利技术实施例3中荧光检测结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术实施例提供了一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，具体包括：(1)探针：北沙参探针，序列为5′-CCGTCGTAGGA-3′；桔梗探针，序列为5′-CTGCGAGGCAC-3′。(2)ITS2引物；正向引物序列为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′(如SEQIDNO.3所示)，反向引物序列为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′(如SEQIDNO.4所示)。(3)PCR反应试剂：DNA聚合酶1×，双蒸水。实施例2本专利技术实施例提供了一种鉴别北沙参和桔梗的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：(1)PCR反应提取待测物的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：体系：待测物的基因组DNA100ng，ITS2引物10pmol/μL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。反应程序：95℃，5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃5min，共1个循环。(2)原位探针结合向扩增引物中加入北沙参探针或桔梗探针1pmol/μL，95℃变性5min，60℃退火1min。(3)电泳检测经1％琼脂糖凝胶电泳检查上述退火后的样品(180V)，10min后在488nm激发波长下进行荧光检验。检验结果如图1所示，图1中左图为加入北沙参探针的电泳结果，右图为加入桔梗探针的电泳结果。北沙参和桔梗样品均出现明显荧光条带，而伪品迷果芹则未出现荧光条带。实施例3本专利技术实施例提供了一种鉴别北沙参和桔梗的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：(1)PCR反应提取待测物的质粒DNA，以该质粒DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：体系：待测物的质粒DNA10ng，ITS2引物10pmol/μL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。反应程序：95℃，5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，其特征在于，包括北沙参探针和桔梗探针，所述北沙参探针和桔梗探针均连接有荧光标记；其中所述北沙参探针的序列为5′‑CCGTCGTAGGA‑3′；所述桔梗探针的序列为5′‑CTGCGAGGCAC‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，其特征在于，包括北沙参探针和桔梗探针，所述北沙参探针和桔梗探针均连接有荧光标记；其中所述北沙参探针的序列为5′-CCGTCGTAGGA-3′；所述桔梗探针的序列为5′-CTGCGAGGCAC-3′。2.根据权利要求1所述的鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括植物ITS2引物。3.根据权利要求1所述的鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记连接于所述探针的5′端。4.根据权利要求3所述的鉴别北沙参和桔梗的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。5.一种鉴别北沙参和桔梗的方法，其特征在于，用权利要求1～4任一项所述的鉴别北沙参和桔梗的试剂盒对北沙参和桔梗进行鉴别。6.根据权利要求5所述的鉴别北沙参和桔梗的方法，其特征在于，具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入所述北沙参探针或桔梗探针进行杂交，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋军娜，刘钊，侯芳洁，樊伟旭，齐兰婷，白佳铭，黄燕飞，王佩燕，
申请(专利权)人：河北中医学院，
类型：发明
国别省市：河北,13